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论文方法介绍-响应曲面法优化高山红景天纤维素酶辅助超声提取工
时间:2021-03-26 16:06:19

  高山红景天(Rhodiola cretinii)主要产于中国主要分布在四川、东北、新疆等地,属于被子植物门蔷薇目景天科红景天属[1]。高山红景天中的主要活性成分是红景天苷,它具有广泛的药理作用,如消除疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗微波辐射、抗肿瘤等作用[2-4],因此红景天苷一直多用于中药的临床治疗。从红景天被开发到现在,对红景天中红景天苷提取工艺的改进一直在推陈出新[5],而有关高山红景天中红景天苷提取工艺的文献多以正交试验方法进行优化,虽然可以节约成本,但程序比较复杂,工作量大[6]。

  对于高山红景天中红景天苷的提取多采用超声提取,能够使提取时间适中和节约试验所需试剂用量,从而节省提取成本并且还能提升提取含量[7]。综合考虑,本试验将超声提取法用于高山红景天中红景天苷的提取。响应曲面法又称RSM,其在提取条件优化方面应用较广泛[8]。本试验将采用Box-Behnken设计实验方案,在中心点反复进行实验,以提高实验精度,减少实验次数[9-10]。使最佳条件更直观的被表现出来,有利于实验的后续进行。

  综合考虑超声提取法和响应曲面法的独有特点,因此本试验将利用超声进行提取并以响应曲面法对最佳提取条件进行优化[11]。以高山红景天中红景天苷提取含量为参考值,通过单因素试验确定最佳提取条件,利用Design-Expert8.0.6软件中的Box-Benhnken设计原理对提取工艺进行优化,优化后的提取工艺将会为红景天苷成分的合理及有效的开发提供科学依据[12]。以后药材使用量将大大减少,节约成本,有利于经济和环境的发展。

  1.1材料

  高山红景天于2019年03月购于长白山汇济堂中药店,经吉林农业科技学院刘俊霞老师鉴定为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)高山红景天(Rhodiola cretinii)根。

  1.2试剂

  所用试剂如表1-1所示:

  表1-1药品

  序号药品批号生产厂家

  1无水乙醇(分析纯)20190810天津市致远化学试剂有限公司

  2冰乙酸(分析纯)20130705天津市进丰化工有限公司

  3甲醇(色谱纯)20180916星马克有限公司

  4柠檬酸(分析纯)20181211天津市致远化学试剂有限公司

  5纤维素酶(50 u/mg)H16A9S58744源叶生物

  1.3仪器

  所用仪器如表1-2所示:

  表1-2仪器

  序号仪器型号生产厂家

  1电热鼓风干燥箱WGL-230B上海沪粤明科学仪器有限公司

  2电子天平AX324ZH奥豪斯仪器(常州)有限公司

  3高效液相色谱仪1260型安捷伦有限公司

  4超声波清洗器KQ-700V济宁天华超声电子仪器有限公司

  5循环水式多用真空泵SHB-III郑州长城科工贸有限公司

  6数显恒温水浴锅HH-4系列金坛市科析仪器有限公司

  2方法

  图2-1红景天苷提取及含量测定流程图

  2.1高山红景天药材的处理

  2.1.1高山红景天药材处理

  将高山红景天粉碎,置于55℃烘干箱中烘至恒重,过40目筛后备用。

  2.1.2高山红景天含水量测定

  根据《中国药典》2015版规定,采用烘干法测定高山红景天中所含水分。高山红景天粉碎,分别精密称取2.0000g 3份,放入烧杯中精密称定重量。置入烘箱内,在100℃下干燥5h后取出,放冷后精密称定,再在上述温度下干燥1h,放冷,称重,至连续两次称重的差异不超过5 mg为止,根据减失的重量,计算供试品中含水量(%)[13]。

  2.2红景天苷含量的测定

  2.2.1色谱条件

  色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm,5μm),流动相为0.5%冰醋酸-水溶液(A)-甲醇(B)。梯度洗脱为0~30 min 0-55%A、30~45 min 55-100%A;流速1 mL/min;柱温30℃;在270 nm波长检测[14-15];进样量10μL。

  2.2.2对照品溶液制备

  精确称取红景天苷标准品1.0000 mg于5 mL的容量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,得到质量浓度均为0.2 mg/mL的对照品溶液[16]。保存在2-8℃冰箱中,备用。

  2.2.3标准曲线

  按照“2.2.1”的色谱条件进样2、4、6、8、10μL检测。以质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标[17]。

  2.3方法学考察

  2.3.1精密度试验

  按照“2.2.1”的色谱条件对对照品溶液进行色谱分析(n=5),记录峰值面积[18]。

  2.3.2重复性试验

  从同一批次取5个样品后,按“2.2.2”方法制备供试品溶液,按照“2.2.1”的色谱条件进行色谱分析并记录峰值面积[17]。

  2.3.3稳定性试验

  按照“2.2.1”色谱条件分别在4、8、12、16、20和24 h对同一样品溶液进行色谱分析并记录峰面积[17]。

  2.3.4加样回收率试验

  按照“2.2.2”的方法制备样品溶液(n=5),精密加入适量对照品溶液,并根据“2.2.1”的色谱条件进行色谱分析[17]。

  2.4单因素对红景天苷提取含量的影响

  2.4.1超声时间的筛选

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-1所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  表2-1不同提取时间对提取含量的影响(n=3)

  时间(min)纤维素酶质量

  分数(%)温度(℃)乙醇浓度(%)次数(次)

  20、30、40、50、60 0.2 40 40 2

  2.4.2纤维素酶质量分数的筛选

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-2所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  表2-2不同纤维素酶质量分数对提取含量的影响(n=3)

  时间(min)纤维素酶质量

  分数(%)温度(℃)乙醇浓度(%)次数(次)

  30 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4 40 40 2

  2.4.3提取温度的筛选

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-3所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  表2-3不同提取温度对提取含量的影响(n=3)

  时间(min)纤维素酶质量

  分数(%)温度(℃)乙醇浓度(%)次数(次)

  30 0.2 30、40、50、60、70 40 2

  2.4.4乙醇浓度的筛选

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-4所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  表2-4不同乙醇浓度对提取含量的影响(n=3)

  时间(min)纤维素酶质量

  分数(%)温度(℃)乙醇浓度(%)次数(次)

  30 0.2 40 30、40、50、60、70 2

  2.4.5提取次数的筛选

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-5所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  表2-5不同提取次数对提取含量的影响(n=3)

  时间(min)纤维素酶质量

  分数(%)温度(℃)乙醇浓度(%)次数(次)

  30 0.2 40 40 1、2、3、4、5

  2.5响应面法优化红景天苷超声提取工艺

  运用Design-Expert8.0.6软件进行Box-Benhnken的响应曲面试验设计,综合单因素考察结果,选取四个最优提取因素,以红景天苷含量为衡量指标,采用四因素三水平的响应面分析方法进行实验设计。

  3结果

  3.1含水量测定结果

  高山红景天含水量测量如表3-1所示:

  表3-1高山红景天含水量测量结果

  试验号烘前试样重(g)烘后试样重(g)含水量(%)平均含水量(%)

  1

  2

  3 2.0000

  2.0000

  2.0000 1.807

  1.802

  1.801 9.65

  9.90

  9.95 9.83

  最终所得含水量为9.83%。

  3.2标准曲线及色谱图

  红景天苷标准曲线为图3-1:

  图3-1红景天苷标准曲线

  红景天苷标准曲线为图3-1线性回归方程为y=38.175x+4.25,R2=0.9999;色谱图见图3-2。

  图3-2高效液相色谱图

  A:红景天苷对照品溶液;B:高山红景天样品溶液

  3.2方法学考察结果分析

  3.2.1精密度考察结果

  表3-2精密度试验研究结果(n=6)

  序号峰面积(A)RSD(%)

  1 112.3

  2 116.9

  3 114.3 0.87

  4 113.2

  5 113.6

  6 111.0

  精密度考察RSD为0.87%,结果表明检测仪器精密。

  3.2.2重复性试验结果

  表3-3重复性分析表(n=3)

  序号含量(mg/g)RSD(%)

  1 4.43 0.84

  2 4.32

  3 4.29

  重复性试验RSD为0.84%,结果表明试验操作重现好。

  3.2.3稳定性试验结果

  表3-4稳定性分析表(n=6)

  时间(h)峰面积(A)RSD(%)

  4 104.5 0.69

  8 105.7

  12 105.3

  16 105.7

  20 104.7

  24 102.8

  稳定性试验RSD为0.69%,结果表明在0~24 h内提取药物稳定。

  3.2.4加样回收率试验结果

  表3-5加样回收率表(n=5)

  序号样品取样量(g)样品含量

  (mg)对照品加入量(mg)测的量(mg)回收率

  (%)平均回收率(%)RSD

  (%)

  1 0.0755 0.4768 0.4700 0.8584 98.1915 97.6155 0.82

  2 0.0758 0.4787 0.4700 0.8732 98.7823

  3 0.0766 0.4839 0.4700 0.8678 96.6172

  4 0.0769 0.4858 0.4700 0.8806 98.8479

  5 0.0748 0.4722 0.4700 0.8514 95.6386

  加样回收率试验RSD为0.82%,结果表明试验方法可行。

  3.3单因素结果分析

  3.3.1不同超声时间的筛选

  表3-6不同超声时间的筛选

  超声时间(min)峰面积(A)含量(mg/)

  20 159.5 2.30

  30 198.0 2.85

  40 200.4 2.89

  50 202.7 2.92

  60 205.0 2.95

  图3-3超声时间对提取含量的影响

  由图3-3可知,时间的不断增长,红景天苷提取含量变化的整体呈先增长、后平缓的趋势,药材中的红景天苷随着时间的增加而逐渐溶解,药材中的红景天苷被提取了出来,但当提取时间超过30 min时药材中红景天苷已完全溶出随时间的增加而不再发生变化,所以红景天苷提取率趋于平缓,因此,本试验做出优化考察的提取时间为20,30,40 min。

  3.3.2不同纤维素酶质量分数的筛选

  表3-7不同纤维素酶质量分数的筛选

  纤维素酶质量分数(%)峰面积(A)含量(mg/)

  0.00 77.2 1.11

  0.10 122.0 1.76

  0.20 205.3 2.96

  0.30 208.6 2.98

  0.40 211.5 3.01

  图3-4纤维素酶质量分数对提取含量的影响

  由图3-4可知,随着纤维素酶质量分数的增加,红景天苷的提取含量也逐渐提高。药材中的红景天苷随着纤维素酶的增加而被提取了出来,但当提纤维素酶质量分数超过0.2%时药材中红景天苷已完全溶出随纤维素酶的增加而不再发生变化,所以红景天苷提取率趋于平缓,因此,本试验做出优化考察的酶质量分数为0,0.2%,0.3%。

  3.3.3不同超声温度的筛选

  表3-8不同提取温度的筛选

  超声温度(℃)峰面积(A)含量(mg/)

  30 172.6 2.48

  40 196.6 2.83

  50 197.3 2.85

  60 198.4 2.86

  70 200.2 2.85

  图3-5提取温度对提取含量的影响

  由图3-5可知,随着提取温度的增加,红景天苷的提取含量也逐渐提高。药材中的红景天苷随着温度的增加而逐渐被提取了出来,但当提取温度超过40℃时药材中红景天苷已完全溶出随温度的增加而不再发生变化,所以红景天苷提取率趋于平缓,因此,本试验做出优化考察的提取温度为30,40,50℃。

  3.3.4不同乙醇浓度的筛选

  表3-9不同乙醇浓度的筛选

  乙醇浓度(%)峰面积(A)含量(mg/)

  30 207.2 2.99

  40 240.3 3.47

  50 244.1 3.48

  60 246.5 3.50

  70 250.2 3.49

  图3-6乙醇浓度对提取含量的影响

  由图3-6可知,红景天苷的提取含量随着乙醇浓度的升高而提高,药材中的红景天苷溶解度逐渐增大药材中的红景天苷被提取出来,但当乙醇浓度到达50%时单因素中乙醇体积分数对于红景天苷提取率的影响到达最高值,此时药材中的红景天苷在此浓度下的溶解度达到最大值,当乙醇浓度超过50%并逐渐升高,药材对试剂的承受极性达到最大值,药材中的红景天苷溶解度也逐渐降低,为了节省试剂成本,因此,本试验做出优化考察的乙醇体积分数30%、40%、60%。

  3.3.5不同的提取次数的筛选

  表3-10不同乙醇浓度的筛选

  提取次数(次)峰面积(A)含量(mg/)

  1 223.7 3.22

  2 265.5 3.98

  3 275.8 3.97

  4 277.3 3.99

  5 278.5 4.02

  图3-5提取次数对提取含量的影响

  由图3-5可知,提取次数的增多,红景天苷的提取含量增高,药材中的红景天苷的溶出度随着提取溶剂用量的增加而增大,当提取次数达到2次时药材中红景天苷溶出度达到最大值,超过2次后药材中红景天苷被全部提出,提取量率趋于平缓,对于后面3~5次提取发现提取率基本不再发生变化,对提取率影响较小,并且次数不易改变,在多次试验之后发现由于提取药材的量较小提取影响因素不明显,所以,将次数固定为提取两次,因此不再考察提取次数的影响。

  3.4正交试验结果及分析

  通过单因素优选出水平及因素,做出正交试验水平表,如表3-11:

  表3-11正交试验水平表

  水平因素

  A提取时间

  (min)B纤维素酶质量

  分数(%)C提取温度

  (℃)D乙醇浓度

  (%)

  -1 20 0 30 30

  0 30 0.2 40 40

  1 40 0.3 50 50

  表3-12红景天苷提取试验Box-benhnken结果

  序号X1 X2 X3 X4红景天苷含量

  (mg/g)

  1 40 0.2 40 50 1.82

  2 40 0.3 40 40 1.76

  3 30 0.2 30 50 0.46

  4 30 0.2 50 50 1.98

  5 30 0 30 40 2.36

  6 20 0.2 40 50 2.79

  7 20 0.3 40 40 2.96

  8 20 0.2 40 30 2.55

  9 40 0.2 30 40 0.98

  10 30 0.2 50 30 2.46

  11 30 0 40 50 2.12

  12 40 0.2 50 40 1.82

  13 30 0.2 40 40 4.49

  14 30 0.2 40 40 4.49

  15 30 0.2 30 30 1.12

  16 30 0.3 30 40 2.34

  17 30 0.2 40 40 4.49

  18 30 0.3 40 30 2.61

  19 30 0 40 30 2.24

  20 30 0.2 40 40 4.49

  21 20 0.3 50 40 3.81

  22 30 0.2 40 40 4.49

  23 20 0 40 40 2.21

  24 30 0.2 40 40 4.49

  25 40 0.2 40 30 2.35

  26 30 0.3 40 50 2.07

  27 20 0.2 50 40 2.11

  28 30 0 50 40 2.89

  29 20 0.2 30 40 0.83

  运用Design-Expert8.0.6软件分析表3-11中的数据,得到红景天苷对乙醇浓度(X1)、液料比(X2)、提取次数(X3)、提取功率(X4)的二元多项模型方程分别为:Y红景天苷=+2.87-0.23*X1+0.043*X2+0.41*X3-0.16*X4-0.15*X1*X2-0.100*X1*X3-0.15*X1*X4-0.12*X2*X3-0.096*X2*X4+0.042*X3*X4-0.57*X12-0.16*X22-0.83*X32-0.49*X42

  表3-13红景天苷Box-benhnken试验回归模型的方差分析

  方差来源平方和自由度均方F值P值显著性

  模型9.52 14 0.68 3.48 0.0070极显著

  A-提取时间0.66 1 0.66 3.38 0.0873

  B-乙醇体积分数0.23 1 0.23 0.12 0.7385

  C-纤维素酶含量0.05 1 0.05 0.52 0.0059

  D-提取温度0.31 1 0.31 1.60 0.2259

  AB 0.089 1 0.089 0.46 0.5095

  AC 0.040 1 0.040 0.20 0.6581

  AD 0.084 1 0.084 0.43 0.5214

  BC 0.057 1 0.057 0.29 0.5966

  BD 0.037 1 0.037 0.19 0.6709

  CD 7.031E-003 1 7.031E-003 0.036 0.8522

  A2 2.11 1 2.11 10.82 0.0054

  B2 0.17 1 0.17 0.88 0.3639

  C2 4.44 1 4.44 22.74 0.0003

  D2 1.56 1 1.56 7.98 0.0135

  残差2.73 14 0.20

  失拟项2.73 10 0.27 2.51

  纯误差0.000 4 0.000

  总和12.25 28

  对红景天苷进行方差分析,数据见表3-12。红景天苷模型的P值(P红景天苷=0.0070),结果表明该模型对超声提取工艺的影响极显著。R红景天苷2=0.8676;变异系数(C·V%)为12.2%、22.34%、26.15%、33.41%;Radj红景天苷2=0.8953;综合分析表明模拟程度良好,试验误差较小。根据回归方程中的各项系数及表3-8回归方程的方差结果可知,所选的因素对红景天苷的提取含量的影响顺序为:纤维素酶含量﹤乙醇体积分数﹤提取温度﹤提取时间。

  图3-6红景天苷提取条件交互作用图

  响应面曲面能够较好的反应单因素或两因素相互作用对红景天苷含量的影响,响应面三维图像如图3-6所示。通过图中相应面的弯曲程度,表明纤维素酶含量对红景天苷含量影响最大,其次为乙醇体积分数以及提取温度,提取时间影响最小。

  运用Design-Expert8.0.6软件优化后微波提取木脂素的最佳工艺条件为:提取时间33 min,纤维素酶质量分数0.2%,提取温度38.4℃和乙醇浓度41.97%。考虑到超声温度参数为整数及实际生产条件,将优化后提取条件调整为提取时间为30 min,纤维素酶质量分数0.2%,提取温度38℃和乙醇浓度为41%。

  3.5验证试验

  3.5.1加入纤维素酶试验

  称取1.0000高山红景天,加入体积分数为0.2%的纤维素酶,调pH值为5,45℃恒温水浴下酶解30 min,加入5 mL浓度为40%的乙醇溶液,置于40℃超声波清洗器中,设定超声波功率为100 W提取30 min,提取两次。将滤液进定容至25 mL容量瓶中,抽取10μL样品按“2.2.1”色谱条件测其含量。

  表3-13加入纤维素酶(n=3)

  峰面积(A)提取率(%)含量(mg/g)

  295.7 9.50 4.39

  提取率为9.50%,提取含量为4,39mg/g。

  3.5.2未加入纤维素酶试验

  称取1.0000 g高山红景天,不加入纤维素酶,调pH值为5,45℃恒温水浴下酶解30 min,加入5 mL浓度为40%的乙醇溶液,置于40℃超声波清洗器中,设定超声波功率为100 W提取30 min,提取两次。将滤液进定容至25 mL容量瓶中,抽取10μL样品按“2.2.1”色谱条件测其含量。

  表3-14未加入纤维素酶(n=3)

  峰面积(A)提取率(%)含量(mg/g)

  40.2 1.28 0.48

  根据试验数据显示,未加入纤维素酶的红景天苷提取率为1.28%,提取含量为0.48mg/g,所以加入纤维素酶后红景天苷提取率明显提高,最优提取条件为提取时间30 min,纤维素酶质量分数0.2%,提取温度38℃和乙醇浓度41%。此条件下的提取率为9.50%,提取含量为4.39mg/g。