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论文相关方法-石榴皮、乌梅对腹泻模型小鼠止泻作用的对比研究
时间:2021-04-07 11:10:09

  本研究旨在探究石榴皮与乌梅的止泻作用。

  方法:将49只健康小鼠随机分为7组,每组6只,分别是空白对照组、腹泻模型组和5个腹泻用药组。采用番泻叶构建腹泻型,然后给模型小鼠灌服石榴皮水煎剂(0.2g/kg,0.4g/kg)、乌梅水煎剂(0.2g/kg,0.4g/kg)、思密达(0.4g/kg)。以腹泻指数、稀便率、腹泻潜伏时间、小肠炭末推进率等为检测指标。

  结果:与空白对照组相比,高剂量(0.4g/kg)组中石榴皮和乌梅水煎剂的潜伏时间分别为135和134分钟,稀便率分别为69.17%和67.69%,两者相差不大。但在低剂量(0.2g/kg)组中,乌梅水煎剂的潜伏时间为125分钟,小于石榴皮水煎剂,两者存在差异(P<0.05)。且乌梅低剂量组的稀便率最低,为60.78%。

  结论:对于番泻叶腹泻模型小鼠而言,同剂量的乌梅水煎剂止泻作用比石榴皮水煎剂的好,且乌梅(0.2g/kg)水煎剂止泻作用较强,可能通过乌梅酸促进消化液分泌,促进消化吸收,使胃排空减缓而达到止泻作用。

  1.1石榴皮与乌梅的概述

  《本草纲目》中记载石榴入药具有渴痢、便血、直肠脱垂、崩中带下的作用。石榴的主要营养器官和生长繁殖的器官均可用其入药。石榴皮为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮[1],外表皮的颜色为暗棕色,表面不光滑带有色泽,形状为片状果皮其大小各不相同且没有规则;内里的颜色为红棕色,有果肉残留的网状凸起痕迹;石榴的外切面的颜色为黄色,质地硬而脆,味酸涩、性温。大量文献已经表明石榴皮可使腹泻病人止泻、流血停止、杀虫等功能,常用于医治经常反复发生腹泻或痢疾、大便带血甚至脱肛、月经症状异常、滑泄、肠道寄生虫聚集而引起腹痛的等病症[1-3]。

  乌梅为蔷薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.etZuce.的干燥近成熟果实[1-2],表面皱缩有凹点呈乌黑色包裹着坚硬的果核,形状大致为椭圆形或类似球形;气味小,味极酸[2]。乌梅果实具有治疗腹泻,收敛肺气,安定蛔虫达到暂时止痛之功效。《本经逢源》和《本草纲目》中明确提到乌梅能敛肺涩肠、益精开胃、止久咳泻痢。因此,现代中医常用乌梅治疗肺气不足,因体虚发热引起的咳嗽,经常发生腹泻或痢疾,多饮消瘦,因蛔虫引起的呕吐或腹痛等症状[2]。

  1.2石榴皮与乌梅的研究现状

  近年来,对石榴的研究中,国内外的很多研究和报道都充分表明了石榴在抵抗癌症、调节血脂、提高机体抵抗力、降低血中的葡萄糖,具有抗氧化、改善循环系统等作用[4],显示出石榴皮突出的生物学活性。在临床上我国石榴皮作为一种抗癌药物的使用历时长久,且在临床应用上已经取得了良好的临床治疗和保健效果。石榴因闻名需求而增加新建了很多石榴酒厂,导致大量的石榴皮被弃用,因此,全国在石榴皮的药用价值的利用上意义重大[5]。大量推广种植石榴,合理分配种植区域,形成正规规模的石榴产区,更好的对石榴和石榴皮的加工利用及相关产品的开发与研究,同时加强石榴中活性成分的研究及完善相关标准,加大对石榴皮资源的利用提供有力的保障。中医药治疗腹泻积累了丰富的临床经验,但多数为临床研究,实验研究较少,动物模型有一定的限制,其相关机制有待更深入的实验研究与临床实践。

  乌梅的数量大、用途广,是我国传统中草药,乌梅含有多种有机酸等营养物质,也可以作为食品原料。乌梅具有止咳、止渴、收敛肺气、治疗腹泻、治疗崩漏不止、安定蛔虫达到暂时止痛的作用。如今人们开始渐渐重视起养生,从各种研究报道了解到更多关于乌梅对身体健康的好处。因此,乌梅提取分离后得到的有效活性成分具有很好的治疗效果,未来探索研究乌梅的重难点将根据乌梅特有的有效活性成分来确定有效活性成分的药理作用机制。

  1.3腹泻的概述

  1.3.1腹泻的不良影响

  腹泻是指排便次数比正常情况明显增加、大便中水含量也有所增多的现象。腹泻时,由于胃肠道是消化吸收营养物质的器官,机体会失去大量的水分,胃肠道对营养物质的吸收产生阻碍,造成机体能量供给存在缺陷或降低机体对蛋白质的吸收,出现机体对抗外界环境各种因素的能力减小,从而出现头昏、易疲劳、看不清等贫血症状。

  腹泻病在全球比较常见,每年因各种腹泻病死亡的人数很多。在畜牧业中,腹泻病对生产养殖也是一个很麻烦的问题,一般春季是腹泻病的高发季,幼畜因腹泻而死亡的死亡率较高造成生产养殖行业的经济收益严重下降[6]。腹泻会导致胃肠道内的动态平衡失衡,肠道菌群发生变化,使畜禽胃肠功能降低或者丧失,机体无法维持正常生命活动,导致畜禽营养不良;对幼畜的生长发育产生影响,个头矮小,机体抵抗力差,贫血和机体神经功能紊乱[7],会增大其他疾病的感染的机率,腹泻严重时,机体中电解质动态平衡打破,使机体酸碱机能紊乱,最后脱水严重与酸碱中毒死亡,在仔猪身上最容易发生[8]。

  1.3.2中医对腹泻的认识

  在很多古典医书中腹泻有名称很多,在分类上也有不同。在《内经》中以腹泻的症状和情况或者根据粪便的性质来分类而有飧泻、洞泻、溏泻、水泻、濡泻等名称。《难经》中以脏腑理论来命名有胃泻、大小肠泻等。从外感分为湿、火、积等;从内伤分脾虚腹泻、食积腹泻、肾虚腹泻等[9]。在张仲景的《伤寒论》中将腹泻称为“利”或者“下利”[10]。腹泻和痢疾是不同的,腹泻主要发生在上腹部以食物和水没有得到充分消化排出的稀便为特征应该调节脾胃的湿气;痢疾主要发生在下腹部以血脂伤败为特征应该治疗肝肾损伤问题[11]。如果出现里急后重、腹痛、大便中有白色脓血的症状是在古时将此病称为痢疾。

  泄泻主要发生在脾脏中,部分也可发生胃、大肠和小肠中,发生该病的原因是机体感受到伤害人身心的外界事物,以湿侵入机体为主因脾脏喜燥而容易伤脾,寒暑病邪对脾脏功能也有一定的影响,从而导致胃肠功能的紊乱发生泄泻;脾主要对食物和水进行消化吸收的转化,胃主要是容纳和初步消化食物,因而饮食不当,如饮食过量、饮食过冷、长期饮食失调、吃了腐败变质的食物也可以影响脾胃的功能;过度劳累反复生病可以导致脾胃功能下降,不能运化水谷从而引起泄泻。

  泄泻在中医治疗上应该先明确发病类型,正确的认识疾病的过程,通过辩证的结果确定治疗方法和手段,理论和实践相结合。

  1.3.2腹泻的防治

  腹泻的防治对人及动物的健康都非常重要,平时注意日常饮食,不要饮食过量,不吃过冷、腐败变质及刺激性食物,注意保暖,注意清洁卫生,环境消毒,避免病原微生物侵入机体引发腹泻[12]。

  腹泻的治疗有抗生素类治疗、止泻剂治疗、益生菌调理肠道菌群、中药类药物。抗生素类主要是对感染性腹泻的治疗效果较好,但长期使用会使腹泻加重或者产生耐药性[13];止泻剂治疗主要用于非感染性腹泻;益生菌主要用于由相关性药物引起的腹泻,先停止使用相关药物,用益生菌并适当添加维生素等营养物质,调节胃肠道环境使腹泻症状减轻[14];中药类药物需要通过煎煮提取药液,使用和治疗都较为麻烦,它的优点是没有耐药性等副作用并对非感染性腹泻和感染性腹泻都有良好的治疗效果[15]。

  1.4研究意义及目的

  鞣质是一种能使蛋白质凝固的物质,它是石榴皮中主要成分,有助于创伤组织愈合或避免其受刺激[16],具有促进胃肠收敛的作用,因而同时具有起到涩肠、止泻、止血的作用功能。近些年来,众多学者如顾政一等[17]对石榴皮多酚凝胶的临床研究结果表明,石榴皮多酚凝胶可使创伤组织愈合时间缩短和愈合动物数量大大增加,但对胃肠道的生理学研究有待进一步完善。赖舒[18]的临床实验研究结果表明:石榴皮中其所含的有效成分鞣质可有效的治疗实验性胃损伤。程会昌[19]等进一步研究了诃子和石榴皮提取物对治疗家兔离体肠管运动的生理学影响,结果显示诃子和石榴皮提取物均能有效抑制肠管的收缩和运动,对不同部位的肠管的运动和生理学影响之间存在明显的差异,剂量增加越多对肠管影响也越大;石榴皮提取物对肠管运动的生理学影响较弱,研究结果可为其他药物的临床试验和应用研究提供可靠的动物生理学临床实验依据。

  乌梅可以做成乌梅丸或乌梅汤都可以用于止泻。乌梅丸出自张仲景的《伤寒论》;乌梅汤由乌梅丸转化而来,用于安定蛔虫达到暂时止痛和治疗腹泻的效果较为明显。乌梅丸能够减少胃内残留率、提高小肠推进率[20],使肠胃功能的恢复加快;乌梅丸也能抑制肠黏膜内血管活性肠肽(VIP)的表达,促进胃肠神经传递介质的消化和表达,胃内物质残留率明显下降,小肠蠕动推进率明显升高,且温热组药物为该方促进患者胃肠功能快速恢复的主要药物[21]。肠易激综合征是以出现腹痛、腹胀、排便的次数和大便性状异常的主要症状的一种肠道系统功能性紊乱性的疾病,有便秘型、腹泻型、混合型、不定向型,随着社会发展和生活水平的提高,我国肠易激综合征(IBS)主要以腹泻型为主,利用乌梅汤治疗腹泻型IBS,具有益气健脾、涩肠止泻的功效和作用。经过时代技术的发展,各种研究报道结果表明乌梅汤能起到治疗腹泻或痢疾,增强机体的对外界环境各种因素的能力,镇痛消炎,抗溃疡作用[22]。

  由此可见石榴皮和乌梅都具有止泻作用。通过查找资料,对两者的比较研究较少,故对石榴皮和乌梅水煎剂止泻作用进行比较研究,为临床用药提供参考。因此,本研究主要对比石榴皮与乌梅的止泻作用为目的,研究观察在高、低剂量下,同种中药对止泻作用在哪种剂量下效果较好;在相同剂量下,比较两种中药对小鼠的止泻作用强度进行对比。

  1.5论文的主要研究内容

  本研究采用番泻叶致小鼠腹泻构建成腹泻小鼠模型,通过灌胃石榴皮水煎剂、乌梅水煎剂,研究两种水煎剂对腹泻模型小鼠的止泻效果的强弱,通过观察正常小鼠稀便率和炭末推进率的影响,根据试验结果初步推测出药物发生的作用机理。

  二、材料与方法

  2.1试验材料

  2.1.1试验动物

  昆明小鼠:49只、6-8周、体重18~22g,雌雄各半,购于山西医科大学实验动物中心。

  2.1.2试验药品

  石榴皮、乌梅干、番泻叶(均购于毫州市永刚饮片厂有限公司)、思密达(购于博福-益普生(天津)制药有限公司)

  2.1.3试验器材

  电子秤、粉碎机、酒精灯、过滤网、冰箱、水箱、烘干器、7号灌胃针、1.0ml注射器、解剖板、手术刀、直尺

  2.2试验方法

  2.2.1试验材料的准备

  2.1.1.1石榴皮、乌梅水煎剂的制备

  用粉碎机粉碎石榴皮和乌梅,用电子秤称取其各100克,各加5倍量水,浸泡50分钟,各自煎煮加热至沸腾持续30分钟,过滤网滤出滤液,水浴浓缩至100 ml,得到石榴皮和乌梅水煎剂。

  2.1.1.2番泻叶水煎剂得制备

  使用电子秤称取番泻叶50克,加6倍量的蒸馏水,煎煮加热至沸腾持续10分钟,蒸发浓缩至50ml浓度为1g/ml[23],存放于4℃冰箱中保存,用时恢复至室温。

  2.1.1.3思密达溶液的制备

  使用电子秤称取思密达3g,加入蒸馏水,用玻璃棒充分搅拌均匀,备用。

  2.2.2腹泻小鼠模型的构建

  将49只健康小鼠随机分为7组,每组7只。将其中1组作为空白对照组,不做任何处理,其余6组小鼠用于制作腹泻模型。本研究采用苦寒中药法构建腹泻小鼠模型,具体方法为:

  (1)对处理组小鼠灌服番泻叶水煎剂(1g/ml),一天一次,剂量为0.4ml/20g;

  (2)灌胃30分钟后,把小鼠放入水箱中让小鼠游泳,气力用尽后捞出小鼠,放入取暖器上烘干,连续6天。

  2.2.3试验设计与分组

  将建模之后的5组小鼠分别给药治疗,根据用药的不同,分为石榴皮低剂量组(0.2g生药/kg)、石榴皮高剂量组(0.4g生药/kg)、乌梅低剂量组(0.2g生药/kg)、乌梅高剂量组(0.4g生药/kg)、思密达组(0.4g生药/kg)[24]、腹泻模型组,具体的处理见表2.1。

  表2.1试验设计与分组情况(单位:生药/kg)

  组别石榴皮乌梅思密达

  空白组0 0 0

  腹泻模型组0 0 0

  石榴皮低剂量组0.2g 0 0

  石榴皮高剂量组0.4g 0 0

  乌梅低剂量组0 0.2g 0

  乌梅高剂量组0 0.4g 0

  思密达组0 0 0.4g

  2.3检测指标及方法

  2.3.1稀便率

  对腹泻小鼠分别灌胃相应剂量的药液,腹泻模型组给予生理盐水,给药量为0.4mL/20g[25]。记录5h内小鼠的总大便数、稀便次数,计算稀便率。稀便率的计算公式为:

  稀便率(%)=(稀便次数/总大便数)×100%[26]

  记录从给药后到开始腹泻的时间,即腹泻潜伏期

  2.3.2腹泻指数

  根据腹泻小鼠在纸上排出的粪便直径大小分级,标准如表2.3.2,计算腹泻指数。

  表2.3.2腹泻小鼠粪便级数

  级数一级二级三级四级

  粪便直径x(cm)<1 1<x<1.9 2<x<3>3

  腹泻指数计算公式为:

  腹泻指数=稀便率×粪便级数[27]

  2.3.3炭末移动百分率

  在各组药液前在药液中加入活性炭,使浓度为1%。小鼠分组灌胃给药剂量同前一样,灌胃40分钟后脱臼处死,使用手术刀解剖小鼠。测量活性炭在小鼠肠道内的移动距离,计算炭末移动百分率。炭末移动百分率的计算公式为:

  炭末移动百分率=(炭末移动距离/小肠总长度)×100%[28-30]

  2.4数据统计与分析

  应用SPSS统计分析软件对数据进行处理,试验结果的数据用()表示,组间差异比较采用单因素方差分析中的最小显著性差异法。

  三、结果与分析

  3.1对小鼠临床表现的影响

  由表3.1可见,空白组与模型组比较存在差异(P<0.05),说明腹泻小鼠模型构建成功。

  表3.1各组腹泻指数

  组别动物数腹泻指数

  空白组7 0

  腹泻模型组7 1.108±0.903

  石榴皮低剂量组7 1.135±0.952

  石榴皮高剂量组7 1.143±0.918

  乌梅低剂量组7 1.185±0.906

  乌梅高剂量组7 1.246±0.934

  思密达组7 1.104±0.901

  空白组小鼠大便正常、精神状态良好、饮食正常、皮毛有光泽;模型组的小鼠灌胃番泻叶水煎剂后,开始表现为大便含水量增加,之后开始排水样便,每天大便次数较空白对照组小鼠明显增加,肛门周围污秽,后期模型小鼠模型组小鼠进食减少,饮水增多,精神躁动不安或倦怠,毛发枯燥无光泽,肛门周围污染严重。在给药后腹泻小鼠的大便性状、精神状态、生活状态及腹泻情况比之前较轻,药物治疗3天后基本恢复正常状态。

  3.2对模型小鼠腹泻潜伏时间的影响

  根据表3.2的结果可以看出,思密达组腹泻潜伏时间最长为140分钟,石榴皮组、乌梅组与空白对照组比较都存在显著性差异(P<0.05)。从所得的数据中分析可知,两种中药都有一定的腹泻潜伏时间。

  3.3对模型小鼠稀便率的影响

  根据表3.3的结果可以看出,石榴皮组、乌梅组与腹泻模型组比较两者都存在显著性差异(P<0.05),其中乌梅低剂量组的稀便率最低为60.78%。高剂量组与低剂量组之间均存在显著性差异(P<0.05),石榴皮低剂量组和高剂量组的稀便率粪便为75.86%和69.17%;石榴皮低剂量组与乌梅低剂量组也存在显著性差异(P<0.05)。从所得的数据中分析可知,两种中药都具有止泻作用,并且乌梅组比石榴皮组的止泻作用强,乌梅低剂量组的止泻作用优于高剂量组。

  表3.2小鼠的腹泻潜伏时间

  组别潜伏时间(min)

  空白组

  腹泻模型组

  石榴皮低剂量组

  石榴皮高剂量组

  乌梅低剂量组

  乌梅高剂量组

  思密达组——

  100±3.128

  113±3.835*

  135±6.124*

  125±4.927*

  134±8.152**

  140±9.296**

  注:与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01

  表3.3小鼠的稀便率

  组别稀便率(%)

  空白组

  腹泻模型组

  石榴皮低剂量组

  石榴皮高剂量组

  乌梅低剂量组

  乌梅高剂量组

  思密达组——

  80.92±7.51

  75.86±5.65*

  69.17±11.87*

  60.78±9.73*

  67.69±13.19*

  73.31±8.86*

  注:与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01

  3.4石榴皮、乌梅煎剂对模型小鼠小肠炭末推进率的影响

  根据表3.4的结果可以看出,腹泻模型组的炭末推进率为72.86%,石榴皮高剂量组和低剂量组的炭末推进率分别为70.97%和69.53%,模型组与石榴皮组差异不显著(P>0.05);乌梅高剂量组的炭末推进率最高达到56.92%,与腹泻模型组的炭末推进率存在显著差异(P<0.01)。