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论文写作模式-金银花提取物和黄芪多糖对金黄色葡萄球菌感染小鼠
时间:2021-04-07 13:20:00

  由于抗菌药物胡乱过度的使用,细菌容易产生耐药性的问题也因而显现出来,而中草药是一种刺激较小、毒性副作用较少、相对安全且不易产生耐药性的药物。本试验选择研究金银花提取物和黄芪多糖对金黄色葡萄球菌感染小鼠的治疗效果。方法:将浓度为1g/ml黄芪多糖0.4g/只提前7天连续注入正常小鼠体内,然后建立感染金黄色葡萄球菌小鼠模型,选用1g/ml金银花提取液灌胃0.3ml/只,观察小鼠的生理活动,临床症状,病理组织变化,并采用国际通用的5级评分法对小鼠的临床症状进行评价。结果:金银花提取和黄芪多糖联合用药后,感染了金黄色葡萄球菌的小鼠精神情况逐渐变好,饮食活动恢复正常,无明显临床症状表现,镜检也未发现病变。结论:金银花提取物和黄芪多糖二者联合用药,对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有明显、快速、高效的治疗效果。

  1.1金黄色葡萄球菌的概述

  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)简称为金葡菌,是直径0.8μm的球型葡萄状菌,其隶属于葡萄球菌属,是革兰氏阳性菌的代表菌。是作为一种重要的人畜共患的病原菌。它在自然环境中无处不在,空气、水、食物、粪便中均能发现它的存在,是仅次于大肠杆菌的第二大感染菌。一旦被感染就会产生明显的临床症状,平时常见的金黄色葡萄球菌感染性疾病主要包括一些皮肤组织类的感染、肠炎、肺炎、心内膜炎、败血症等等[3]。金黄色葡萄球菌感染还可以引起雄鼠化脓性睾丸炎和雌鼠子宫内膜炎,以及可以通过胎盘垂直传递给子鼠,严重地影响了鼠群的发育繁殖和动物试验的进行[4]。

  1.2金银花提取物生物学功能

  金银花属忍冬忍冬科,其在我国的资源十分丰富,通过试验表明,忍冬的功效明显较高,南北朝梁代陶弘景在《本草经集注》记载“处处皆有,似藤生,凌冬不凋,故名忍冬。忍冬,味甘,无毒。主治寒热身肿。久服轻身,长年益寿。”由此可以看出金银花具有抗炎清毒、宣散风热的功效。金银花中所含有的木犀草素,绿原酸对金黄色葡萄球菌的生长繁殖有抑制作用[5]。木犀草素可以抑制ERK1/2、JNK1/2和NF-KB炎症因子的转录,调节细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和GM-CS的活性,减少促炎细胞因子和炎症介质的产生[6]。绿原酸是金银花的主要有效成分之一,试验表明绿原酸可以增强免疫球蛋白IgE、IgG1和细胞因子IL-4、IFN-γ和IFN-α的表达,以及增强巨噬细胞的免疫功能[2]。在实际对金银花药理作用开展研究的过程中,发现其还具有调节免疫应答以及促进细胞因子功能的作用[7]。金银花提取物所具备的抗菌、抗炎、抗病毒、增强机体免疫力、清除氧自由基、调节体内多种酶类及降血脂、血糖等功效,在兽医临床治疗中被广泛的应用[8]。在对金银花提取物的研究试验中,许钦坤验证了金银花提取物对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)的值为31.25mg/ml[9]。国外有关研究发现金银花的水、醇提物对金黄色葡萄球菌标准菌株、溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、科氏葡萄球菌等均具有较强的抑菌作用,MIC的范围在37.5~100 mg/ml[10]。在雷玲试验报告中得知金银花提取物(绿原酸、木犀草素)浓度为10mg/ml时具有抵抗内毒素的作用,金银花浓度在5.625g/kg时起着去热的效果,在45g/kg时表现抵抗炎症的效果[11]。由此看来,金银花提取物既能够提高动物机体免疫力,还对金黄色葡萄球菌有较为良好的抑制效果。

  1.3黄芪多糖生物学功能

  黄芪药用历史悠久,可益气固表,托疮生机等。豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.var.mongholicus(Bunge.)或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的主要提取物之一就是黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide,APS),其具有提高免疫力、抗菌抗病毒、抗肿瘤、调节血糖等作用。毛晓峰报道了1%浓度时的黄芪多糖对金色葡萄球菌具有抗菌作用[12]。黄能研究表明黄芪多糖对血清中初期渗出表达的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α具有抑制作用,说明黄芪多糖对烫伤引起的炎症反应具有抑制作用[13]。黄芪多糖还能够激活小鼠T细胞以及巨噬细胞,让炎症因子得以表达,从而使抗菌活性得以增强,增强了免疫能力,免疫稳态得以保持[14]。有试验用黄芪多糖腹腔注射肠缺血再灌注损伤的大鼠,结果显示黄芪多糖能提高CD3+、CD4+等因子的表达水平,说明黄芪多糖可提高免疫功能[15]。王晓曼等发现黄芪多糖能通过增强巨噬细胞的吞噬功能,提高小鼠的免疫功能[16]。在杨玉艾的试验报告中,她发现黄芪多糖对导致奶牛乳房炎主要致病菌链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌都含有一定的抑菌效果[17]。黄芪多糖用来改善小鼠的临床症状有着显著的效果,在增强小鼠免疫能力的同时还能够有效抑制小鼠的细菌感染。

  1.4试验目的及意义

  金黄色葡萄球菌虽然对于红霉素、青霉素、磺胺类等抗生素特别敏感,但对这些抗生素比较容易产生耐药性,所以在治疗被其的感染的疾病时,此类抗生素便比较难产生很好的治疗效果。而中草药毒性小,副作用比较少,且不易产生耐药性等优点,正适合于治疗金黄色葡萄球菌的感染。通过众多研究可知,金银花提取物和黄芪多糖都有着提高免疫力,抑制金黄色葡萄球菌产生的作用。所以本次试验选用金银花提取物与黄芪多糖取替抗生素,对接种金黄色葡萄球菌后的小鼠进行治疗,并观察其治疗效果,对比分析金银花提取物和黄芪多糖各自的治疗效果及主要发挥的作用等。本试验选用小鼠作为试验对象的原因,是因为对于健康的小鼠来说,感染金黄色葡萄球菌后其有呕吐、腹泻、发热等明显的临床症状,而且与体积较大的试验动物相比,小鼠的饲养管理方便、试验操作更为简单容易[18],使试验的结果更为准确。本课题通过研究金银花提取物和黄芪多糖对感染金黄色葡萄球菌小鼠治疗效果的建立,为以后的临床治疗留下快速效的治疗方案。

  2研究方案

  2.1试验材料

  金银花购买于晋中市同济大药堂,黄芪购买于晋中市同济大药堂,试验室保存的金黄色葡萄球菌,试验室自备的蒸馏水、95%乙醇和生理盐水。

  2.2试验器材

  高精度电子天平、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、超速离心机等。

  2.3试验动物及分组

  本次试验一共需要8周-9周龄,体重(20±2)g的健康小鼠40只,雌雄各半。将这40只小鼠随机分成5组,即空白对照组、模型组、金银花提取物组、黄芪多糖组、金银花提取物和黄芪多糖组,每组8只。

  2.4试验方法

  2.4.1金银花提取物的制备

  用电子天平称取金银花100 g后,加入到1000ml蒸馏水中,浸泡1h然后煎煮45min,用多层纱布过滤得到提取液,剩余残渣内加蒸馏水500ml,煎煮20min,合并两次过滤后的液体,水域浓缩后得到100ml金银花提取液,其浓度为1g/ml,经过高压蒸汽灭菌后,放于4℃冰箱中保存,备用。

  2.4.2黄芪多糖的制备

  用电子天平称取黄芪100g,加入到1000ml蒸馏水中,煎煮45min,用多层纱布过滤得到提取液,连续重复三次,合并三次过滤后的滤液,水域浓缩得到100ml浓度为1g/ml黄芪水后,将其放入超速离心机,过滤得滤液,将95%的乙醇调至浓度75%,在室温下静置10h,过滤干燥后得到黄芪多糖,密闭放于4℃冰箱中保存,备用。

  2.4.3感染小鼠的保护试验

  黄芪多糖组,金银花提取物和黄芪多糖组的小鼠,需灌胃黄芪多糖,小鼠的灌胃剂量是每次0.4g/只、每天1次,黄芪多糖的灌胃需要在建立模型的前7d开始进行,其他三组的小鼠用相同剂量的蒸馏水来代替进行灌胃。注意:黄芪多糖的灌胃只进行7d,在建立模型后即停止用药。

  黄芪多糖灌胃7d结束后,开始进行试验。模型组、金银花组、黄芪多糖组、金银花提取物和黄芪多糖组,4组小鼠需要皮下注射接种金黄色葡萄球菌0.1ml,空白对照组小鼠皮下注射等量生理盐水,注射接种4h后,金银花提取物组和金银花提取物和黄芪多糖组小鼠用1g/ml金银花提取液灌胃0.3 ml/只,模型组和黄芪多糖组给小鼠灌胃等量蒸馏水,每天1次,连续7d。详情见表2.1。

  每天及时观察和记录灌服药物后小鼠的精神状态,生理活动。死亡的应马上解剖,观察其发生病变的脏器等,试验需要持续观察记录7d。在试验7d之内没有死亡的小鼠,到第8d时,也需要将其处死并做病理剖检,观察对比发生的变化。

  表2.1试验小鼠分组和处理

  组别灌胃处理(1-7d)皮下注射8d灌胃处理(8-17d)

  空白对照组蒸馏水0.4g/只0.1ml生理盐水0.3ml蒸馏水

  模型组蒸馏水0.4g/只0.1ml金黄色葡萄球菌0.3ml蒸馏水

  金银花提取物组蒸馏水0.4g/只0.1ml金黄色葡萄球菌金银花提取物,浓度1g/ml,0.3ml/只

  黄芪多糖组黄芪多糖0.4g/只0.1ml金黄色葡萄球菌0.3ml蒸馏水

  金银花提取物和黄芪多糖组黄芪多糖0.4g/只0.1ml金黄色葡萄球菌金银花提取物,浓度1g/ml,0.3ml/只

  2.5指标检测

  2.5.1小鼠生理活动观察

  为了对小鼠的临床症状进行专业精准的评价,本试验使用国际通用5级评分法。0分提示小鼠正常,未见异常表现,1分提示小鼠的精神状态沉郁萎靡,懒动嗜睡,食欲低下,2分提示小鼠体表被毛竖立粗乱,肛门部有一些的污秽不洁的黏着物,3分提示小鼠面部开始显现青色并越来越深,其接种的部位也变为青紫色,4分小鼠极度脱水,精神状况严重衰弱,上半身严重水肿,接种部位已经化脓病变,5分小鼠处于濒临死亡的状态,或已经死亡。

  2.5.2切片制作

  试验需在无菌情况下,取下小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官,通过中性甲醛溶液进行固定,制作成组织切片,进行革兰氏染色后,镜检观察病理组织变化。

  3结果分析

  3.1临床症状观察

  空白对照组的小鼠在试验期间精神情况很好,饮食活动无异常。接种感染了金黄色葡萄球菌的模型组小鼠,在接种的第4h就出现了精神状态沉郁萎靡,懒动嗜睡,食欲低下,饮水减少等症状,第1d结束时所有小鼠被毛均已竖立粗乱,肛门部残留有污秽不洁的黏着物。半数小鼠面部开始显现青色,接种的部位也变为青紫色。在试验的第2d就发生了小鼠死亡的现象,所有小鼠的临床症状已十分严重。

  模型组在试验的7d内小鼠死亡率高达87.5%,经过病理解剖检查,发现了无论是已经死亡的小鼠,还是试验期间没有死亡在第8d人工处死的小鼠,肉眼可见肝脏肺脏发生严重淤血,脾脏肾脏肿大,肾脏内含有大量炎性渗出物,胃肠粘膜充血水肿,出现出血点和溃疡,脑部充血水肿,睾丸、卵巢、子宫都有充血水肿现象,少量小鼠发现胸腺有轻微出血。金银花提取物组的小鼠在感染了金黄色葡萄球菌后没有产生死亡现象,全部存活。但在第2、3d连续维持在症状高峰期,到第4d时小鼠整体的精神状态明显改善,往后3d小鼠情况逐渐良好,试验结束的第7d,虽没有完全痊愈的小鼠,但小鼠的临床症状表现轻微。第8d将小鼠全部处死,对其进行病理剖检,结果发现小鼠肾脏内仍含有少许的炎性渗出物,但与模型组相比明显减少。我们可由此推论,如果治疗时间足够充足,那么小鼠在金银花提取物的治疗作用下定能完全恢复正常。

  黄芪多糖组初次出现小鼠死亡现象是在接种试验后进行的第4d,试验第7d结束时小鼠死亡率为62.5%。小鼠接种金黄色葡萄球菌后,第1,2d症状相对较弱,直到第4d才出现小鼠死亡,往后的3d小鼠症状越发严重。对试验结束后未死亡的小鼠进行剖检,肉眼观察可见肝脏肺脏发生淤血,脾脏肾脏肿大,肾脏内含有较多炎性渗出物,胃肠粘膜出现充血水肿,脑部也发生充血水肿,睾丸、卵巢、子宫都有充血水肿现象。

  金银花提取物和黄芪多糖组,二者联合用药,小鼠没有表现出严重的临床症状,在第2d仅有25%的小鼠接种部位变为青紫色,在接种试验后的第5d已有小鼠机体恢复正常。到了第7d时,37.5%的小鼠精神状态已经没有异样,剩余小鼠仅有轻微临床症状表现。第8d处死全部小鼠进行病理检查,肉眼观察没有发现异常,肾脏内已经没有了炎性渗出物的存在。详细结果见表格3.1。

  3.2切片观察

  空白对照组镜检无病变存在。

  模型组小鼠镜检观察组织切片变化发现,肝脏发生实质性坏死,肺间质血管四周出现水肿出血,出现有浆细胞和淋巴细胞浸润;睾丸输精管粘膜,精囊间质内和子宫粘膜均出现有巨噬细胞和淋巴细胞浸润,子宫粘膜出现脱落,卵巢红细胞变性,有大量结缔组织,卵泡坏死[3]。

  金银花提取物组组织切片镜检观察发现各脏器含有轻微的水肿,淤血已消失。睾丸、子宫、卵巢已恢复正常。

  黄芪多糖组镜检发现,肝脏坏死,在肺间质血管的四周出现水肿出血,出现有浆细胞和淋巴细胞浸润;睾丸输精管粘膜出现有巨噬细胞和淋巴细胞浸润,卵巢有较多的结缔组织[4]。

  金银花提取物和黄芪多糖组进行镜检观察未发现有病变残留。详细结果见图3.1

  表3.1小鼠临床症状表现评分

  建模后1-7d状态评分空白对照组模型组金银花提取物组黄芪多糖组金银花提取物和黄芪多糖组

  1d 0 3+2+3+3+2+3+2+3=21 3+2+2+3+2+2+2+3=19 3+2+2+1+2+2+1+1=14 1+1+1+2+2+0+2+1=10

  2d 0 5+4+3+3+3+4+3+3=28 4+3+3+2+3+3+4+4=26 3+3+2+2+3+2+2+2=19 2+2+2+3+3+1+2+2=15

  3d 0 5+4+4+4+4+5+3+3=32 3+4+3+3+3+3+3+4=26 3+3+3+3+3+2+3+3=23 2+2+2+2+3+2+2+2=17

  4d 0 5+5+4+4+5+5+4+4=36 3+3+3+3+3+2+2+3=22 5+3+3+4+3+3+4+3=28 2+2+1+1+2+2+2+1=13

  5d 0 5+5+4+4+5+5+5+4=37 3+2+2+3+3+2+2+3=20 5+4+4+5+3+3+3+3=30 2+1+1+0+2+2+2+1=11

  6d 0 5+5+5+4+5+5+5+4=38 2+2+2+2+3+2+2+2=17 5+4+4+5+5+4+3+4=34 1+0+1+0+1+2+2+1=8

  7d 0 5+5+5+5+4+5+5+5=39 2+2+1+1+2+2+2+1=13 5+5+4+5+5+5+4+4=37 0+0+1+0+1+1+1+0=4

  表3.1小鼠心、肝、肾的病理学观察

  3.3金银花提取物和黄芪多糖对接种了金黄色葡萄球小鼠的治疗效果

  从试验结果来看,模型组小鼠的临床症状表现十分迅速,在接种的第2d及进入症状的高峰期,持续不降,直至小鼠死亡。解剖后发现小鼠肝脏肺脏水肿,且有大面积淤血,脾脏出现坏死情况且内部平滑肌已变性[3],肾脏内有大量炎性渗出物,说明金黄色葡萄球菌有着高强度的致病性,一旦被感染就会展现出明显的病症。

  对比来看,黄芪多糖组的小鼠在接种初期临床症状较轻,高峰期相比于模型组晚到达2d,由此可见黄芪多糖能够明显提高小鼠的免疫力,有效的减轻小鼠初期发病时的症状,并且对疾病的发生起到抑制和预防的效果[19]。

  金银花提取物组,没有小鼠死亡,本组的高峰期只持续了2d,相较于模型组的前2d分值较低,但斜率相似,说明金银花提取物对小鼠的免疫作用虽然存在,但效果较低。而接下来的4d小鼠的临床症状逐渐减轻,试验结束时小鼠虽未被治愈但已有明显改善,说明金银花提取物对接种感染了金黄色葡萄球菌的小鼠有着比较明显的治疗效果,能有效的抑制炎症的表达,但所需时间较长。

  对比黄芪多糖组和金银花组,黄芪多糖组前3d折线斜率低于金银花组,发病症状较轻于金银花组。到第4d,金银花组折线图出现转折,逐渐开始下降,相反黄芪多糖组症状开始爆发,分值持续上升。试验结果表明黄芪多糖的主要作用是提高小鼠机体免疫,有效控制金黄色葡萄球菌在前期感染阶段的症状表达,但后期作用效果便不再明显。金银花提取物虽然对前期症状的爆发没有产生特别好的控制效果,但随着时间的进行,后期可较好控制症状,抑制炎症的表达。黄芪多糖通过提高小鼠免疫力,来抑制金黄色葡萄球菌的表达,而金银花提取物虽也有提高机体免疫的效果,但相比较而言,最显著功效是抑制金黄色葡萄球菌,减少炎症的发生。在本试验的联合用药中,黄芪多糖主免疫,金银花提取物主抗炎。

  对于金银花提取物和黄芪多糖组,因为二者联合用药,小鼠整个试验期间没有产生4分及以上的临床症状,且在第3d明显发生好转,在第5d时就有了精神状况,饮食活动恢复至正常的小鼠,对比恢复健康的小鼠与空白对照组的小鼠表现并无差异。试验结束的第7d,虽有半数小鼠没有达到最好的状态,但已经基本没有明显的临床症状。剖检后肉眼观察小鼠脏器已经没有病变存在,镜检也无发现任何异常,小鼠基本恢复。由此可见,黄芪多糖和金银花提取物二者联合用药,作用效果完美结合,对感染了金黄色葡萄球菌的小鼠有着较为优秀的治疗效果,具体情况见图表3.1。