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论文相关方法-盘基网柄菌Ate1蛋白生物信息学及抗原表位分析
时间:2021-04-09 15:59:27

  盘基网柄菌是一种分子模型生物,Atel蛋白基因介导的翻译后精氨酸化影响盘状盘上皮的底物粘附和细胞迁移,可使肌动蛋白和其他肌动蛋白细胞骨架动力学调节因子发生反应。为进一步的了解和运用Atel,此文运用生物信息学技术对Atel开展多方面分析和测算,期望不但能探索特定蛋白质的一般细胞生物学功能,而且还可以对人类疾病的研究提出基本依据。运用Lasegene中的Protean软件查找到Atel蛋白的氨基酸序列,基于氨基酸序列分析网络和其他分析设备,分析此蛋白的各种特性。Atel蛋白的理化性质与ProtScale和ProtParam结合分析。可以使用美国国家生物技术信息中心:National Center of Biotechnology Information(简称NCBI)的保守域库获取Atel蛋白的保守域。用美国国家生物技术信息中心:National Center of Biotechnology Information(简称NCBI)中的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,简称BLAST)比较了Atel和模式生物序列,测算了Atel蛋白的相似性。运用Lasegene中的Protean和SWISS-MODEL网站测算并解析,蛋白质空间结构。根据数据,Atel蛋白有629个氨基酸残基,属亲水蛋白。和同源的模式生物类似,模式生物能够协助了解胚胎发育及增强免疫细胞功能。

  1.2实验方法

  1.2.1 Atel化学和物理特性测算

  把Atel氨基酸序列粘贴到Lasegene中的Seqbuilder转换为SBD格式,再打开Lasegene软件中的protean进行化学和物理特性测算。

  1.2.2 Atel保守结构域测算

  通过美国国家生物技术信息中心:National Center of Biotechnology Information(简称NCBI)中的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,简称BLAST)搜寻到Atel保守结构域[7]。

  1.2.3 Atel相似性测算和进化解析

  Atel的Fasta序列通过美国国家生物技术信息中心:National Center of Biotechnology Information(简称NCBI)中的基本局部比对搜索工具比较模式生物的序列[8][9]。

  1.2.4 Atel空间结构测算

  运用PredictProtein线上网络对Atel蛋白的二级结构进行测算。

  利用SWISS-MODEL网站,ExPASy资料库,运用同源建模办法,测算Atel的三维空间结构[10]。

  1.2.5 Atel抗原表位测算

  用Lasegene软件中的Protean对抗原指数分析进行Atel蛋白的抗原指数进行测算。

  2结果与分析

  2.1 Atel化学和物理特性

  疏水性参数是氨基酸固有性质,蛋白最终三维空间结构的重要原因之一,是由亲水或者疏水决定的。Atel蛋白的疏水性测算结果是用Lasegene软件中的Protean分析获得的(图2)。得到Atel蛋白的最小值是-3.589,分别位于373,344,375,376,377,378,亲水性最强。最大值是2.344,分别位于457,458,疏水性最强。总结以上资料分析,得出该蛋白是亲水蛋白。

  图2 Atel疏水性测算

  经Lasegene中的Protean软件测算Atel蛋白的化学和物理特性,Atel长度为629,分子质量73819.68,等电点5.97,酸性氨基酸(门冬氨酸谷氨酸)数目为99,碱性氨基酸(精氨酸赖氨酸)数目为91,不稳定指数是38.52(II),本结果证明该蛋白是稳定的。

  2.2 Atel保守结构域测算

  Atel蛋白用美国国家生物技术信息中心:National Center of Biotechnology Information(简称NCBI)中的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,简称BLAST)。测算结果为;Atel具有ATE-N、NAT-SF保守结构域(图3),属于ATE N和NAT SF超家族。

  图3 Atel保守结构域

  2.3 Atel的相似性和进化测算

  分析美国国家生物技术信息中心:National Center of Biotechnology Information(简称NCBI)中的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Too,简称BLAST)后,发现盘基网柄菌Ate1家族与小鼠的相似性为64.37%,与大豆、拟南芥、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、人类、酿酒酵母、果蝇的Ate1蛋白的相似性分别为60.17%、59.84%、58.41%、57.43%、53.79%、47.47%、46.60%。MEGA7.0中的结构1蛋白和模型生物(拟南芥、黄豆、果蝇、秀丽隐杆线虫、人类、鼠类、斑马鱼、粟酒裂殖酵母、盘基网柄菌)Ate1蛋白(图4在进化关系中,我们可以断定,Atel跟斑马鱼、黄豆、小鼠、拟南芥关系最密切。

  图4 Atel系统进化树

  2.4 Atel二级结构测算

  利用PredictProtein网站,算法使用神经网络,测算Atel二级结构(图5),得出以下结论:Atel是混合蛋白,二次结构不规则卷曲占比最大,是70.75%,随机卷曲为相应蛋白的18.44%、α螺旋为相应蛋白10.81%。用H代表α螺旋、用E代表β折叠、用H代表无规则卷曲。

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  图5 Atel二级结构测算

  氨基酸残基:Amino acid residues,简称AA。预测二级结构:Secondary structure of prediction,简称PROF_sec。预测二级结构可信度:Reliability of prediction secondary structure,简称Rel_sec。预测二级结构集合:Set of predicted secondary structures,简称SUB_sec。α-螺旋:Alpha helix,简称H。β-折叠:β-folding,简称E。随机卷曲:random coil,简称L。

  2.5 Atel三维结构测算

  在SWISS-MODEL网站中,提交从UNIPROT得到的Atel蛋白序列匹配到最接近的结果,Atel三维模型如图6。

  图6 Atel空间结构测算

  用全局方法的qmenscore 4,测算模型的置信值计算是-3.62,Cβ值是-2.24,All Atom值是-1.50,solvation值是-1.55,torsion值是-2.48,表明模型是可参考的,置信度评估为图7。结果表明,预测的蛋白质空间结构与5isv.1.A的蛋白质具有10.98%的序列一致性。同源建模,是在满足同源建模的基本条件,大于30%且目标序列和模板序列非常同步的情况下最具参考价值的方法。

  测算了该蛋白氨基酸序列并对比同源建模蛋白质相近波形,结果表明其波形比较稳定。用X-ray方法后,该蛋白的变异率是1.35,匹配范围是446-532,适用范围是13.7%。

  图7模型可信度评价

  2.6 Atel抗原指数测算

  应用lasegene中的protean软件经SeqBuilder转换Atel序列格式,然后经Protean分析得到线性表位,结果如图8。与现有蛋白质结构预测方法Jameson-Wolf相结合,寻找预测潜在抗原决定因素的表位索引-子eson-Wolf。方法结果显示抗原决定因素的26个峰值。

  图8 Atel抗原指数测算

  3讨论

  生物信息学是一门新兴学科。它将计算机科学、信息技术、生物学运用在一起,展现了庞大且繁复的大数据造成的生物学背后之谜。有关Atel蛋白的各种资料是通过生物信息学技术测算的,我们希望可以向研究胚胎生长,提供细胞免疫功能的资料。

  通过Lasegene中的Protean软件测算的最小值为-3.589的氨基酸位于373,344,375,376,377,378,亲水性最强。最大值为2.344的氨基酸位于457,458,疏水性最差。运用以上资料得出了Atel是亲水蛋白。Atel长是629,分子量是73819.68,等电点是5.97,酸性氨基酸(门冬氨酸加谷氨酸)数目是99,碱性氨基酸(精氨酸加赖氨酸)数目是991,不稳定指数是38.52。MLH1具有ATE N和NAT SF保守域,属于ATE N和NAT SF超族。利用PredictProtein网站,采用神经网络算法,测算了Atel的二次结构是MLH1中最规则的卷曲次数最多、不规则卷曲明显、稳定的结构。

  通过Atel的同源性及进化分析发现盘基网柄菌Atel蛋白与人类Atel蛋白同源性达53.79%,因此可以为人类疾病的研究做出基本贡献。精氨酸化是由一种进化保守酶引发的,该酶将精氨酸从tRNA转移到蛋白的n端,即精氨酸转移酶1(Ate1)。精氨酸化是一种广泛存在的PTM,最近的研究表明,精氨酸化与许多重要的生物学过程相关,如胚胎发育、心血管发育、神经嵴细胞迁移和癌症[11][12]。通过活细胞显微镜观察肌动蛋白细胞骨架动力学,发现与野生型细胞相比,肌动蛋白细胞骨架动力学发生了显著变化,翻译后修饰(PTMs)已被描述为细胞骨架蛋白肌动蛋白,包括磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化和羰基化,并被证明对大量不同细胞的完整性是重要的[13]。

  经数据表明,Ate1精氨酸可使肌动蛋白和其他肌动蛋白细胞骨架动力学调节因子发生作用,并表明Ate1功能在调节细胞粘附和迁移中发挥重要作用。有报道称,在体内,不仅n端残基,而且肌动蛋白侧链也能被Ate1精氨酸化[14],并发现肌动蛋白的核苷酸编码序列在体内调节蛋白精氨酸化的速率。不仅是肌动蛋白,许多其他蛋白质也被证明发生精氨酸化,包括细胞骨架的重要结构成分和调节因子[15]。这些结果强调了精氨酸化的复杂性和相关性,并强调了其对重要细胞过程如细胞粘附和迁移的推定影响。

  学者们研究得到,在小鼠和苍蝇中敲除Ate1会导致胚胎致死[16]。Ate1在盘基网柄菌中不是必需的,因为在敲除Ate1基因后,生长和发育并没有受到实质性的影响。然而,Ate1缺失细胞表现出一些显著的特征。与野生型细胞相比,它们的体积明显缩小,外观更圆。为了量化细胞大小的减少,用血细胞比容管进行体积测量。与野生型相比,Ate1null细胞的体积约小20%,但细胞核大小和DNA含量与野生型相比没有显著变化。虽然经trtc-phalloidin染色的Ate1缺失细胞在F-actin的定位和总量上没有显著差异。DdAte1可能影响皮质肌动蛋白的细胞骨架功能。

  在盘基网柄菌,肌动蛋白在细胞粘附有至关重要的作用在接触区域形成瞬时胶粘剂疫源地的衬底[17]。量化在野生型和Ate1-null细胞粘附点。Ate1缺失的细胞几乎完全缺乏肌动蛋白粘附焦点。结果表明,黏附细胞所需的肌动蛋白的一个亚部分或细胞骨架成分受到盘基网柄菌中缺失功能性Ate1的影响。表达RFP-LimEΔcoil ate1-rescued细胞表明肌动蛋白焦点的形成在衬底附着力网站几乎完全恢复。当ate1null细胞表达GFP-LimEΔcoil被压缩在琼脂夷为平地,他们在面临的衬底区域actin-containing结构形成,但这些结构表现出不同的动态性而短暂的肌动蛋白疫源地。Ate1缺失和被救细胞的表型表明,在介导肌动蛋白粘附形成的过程中,Ate1介导的精氨酸化是至关重要的。

  学者们对突变细胞的表型分析提供了强有力的证据,证明DdAte1,即D.disticideum中表达的精氨酸转移酶,参与了细胞粘附以及细胞骨架活动的调节,影响了细胞的迁移。虽然DdAte1很可能除了肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白外,还有其他的靶点,但是通过质谱分析收缩肌动球蛋白样品的结果和使用标记为gfp的DdAte1进行的定位研究表明,它对肌动蛋白的细胞骨架动力学具有调节作用[18][19]。

  总之,盘基网柄菌为今后的研究提供了一个有趣的系统,以研究Ate1对参与粘附或迁移的细胞骨架蛋白的调节的重要性[20]。另一个未被探索的领域是精氨酸化在发育过程中的作用。早期对盘基网柄菌精氨酸化的研究已经为不同的底物在发育过程中不同的精氨酸化提供了证据[20]。在单细胞模式生物中,盘基网柄菌是少数几个发现与Ate1同源的例子之一,因此该生物可能与最近的真核生物共同祖先密切相关。这使得盘基网柄菌成为一个非常有前途的系统,来研究精氨酸化的最低要求及其在未来肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白的相互作用和调控中的基本作用[21][22]。