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论文方法大全-水稻色素相关基因Ai敲除突变鉴定
时间:2021-04-12 09:17:59

  杂交水稻的出现为全球粮食增产和安全提供了保障,但是杂交稻因为在制种过程中周期长、环节多,所以容易引起杂交水稻的纯度出现降低。目前常用的水稻杂交种子纯度检测方法具有成本高、局限性大等问题,因此需要探索一种经济、快速、准确的杂交稻种子纯度鉴定方法。而芽鞘紫线鉴定法就是利用杂交稻在苗期所具有的一种色素标记性状进行杂交稻纯度的快速、准确、经济鉴定。

  首先,本研究对课题组利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Ⅱ-32B(芽鞘有紫线)中与芽鞘色素合成相关的OsAi基因而获得的水稻材料,进行无转基因成分单株的筛选,以减少人们对转基因植物的忧虑,同时也可避免基因编辑系统在后续世代中再次发生编辑产生新的突变。利用潮霉素转基因检测引物筛选后,共获得非转基因单株13株。

  其次,对筛选出的单株DNA的靶点区域进行PCR扩增、产物回收和克隆,随机挑选部分阳性克隆进行测序,以确定OsAi基因的突变形式。结果表明,最终筛选出的单株中OsAi基因出现了多种突变方式,基本以缺失突变为主。其中,A5(-1、-5)、A9(-5)、A15(-3)、A21(-11)、A29(-6、-9)和A23(-1、-2)六个单株在靶位点出现了大片段的缺失突变。

  上述无转基因成分和OsAi基因发生突变的单株可用于选育芽鞘无紫线的II-32B,进而通过回交获得芽鞘无紫线的II-32A,并配制出能够快速准确进行纯度鉴定的杂交稻组合。

  1.1杂交稻纯度鉴定现状

  现阶段,全球杂交水稻种植面积累计已超过5亿hm2,增加粮食达6.25亿Kg,在人口不断增加的今天,杂交水稻的诞生为解决粮食短缺问题提供了重要的突破,带来了巨大的粮食增产优势,保障了全球的粮食安全[1]。所谓杂交稻种子纯度是指杂交种子在特征特性方面的一致程度[2],是反应杂交稻种子质量的重要指标。杂交稻种子纯度的高低决定了杂交稻能否持续保持稳产、高产,以及杂交稻种子质量和产品品质的好坏[3]。据有关单位调查显示,杂交水稻纯度每下降1%,亩产要少收4-5 Kg;纯度下降10%后,杂交稻的增产优势就彻底丧失了[4],由此可见要保障杂交稻的持续增产就必须提高杂交稻种子纯度。但由于杂交稻在制种过程中具有耗时长、环节多的特点,容易出现生物学混杂和机械混杂等现象,从而导致杂交水稻的纯度降低,进一步降低杂交稻的粮食增产优势。因此科学家们对解决目前常用的杂交稻纯度鉴定成本高、耗时长等问题进行了深入研究,希望探寻一种经济、快速、准确的杂交稻种子纯度鉴定方法。

  1.2杂交稻纯度鉴定方法

  1.2.1传统杂交稻种子纯度鉴定方法

  1.2.1.1田间小区种植鉴定法

  田间小区种植鉴定是在杂交稻种子中选取一定数量的样品,采用异地、加代种植的方法,根据植物在田间种植期间的形态特征和生物学特性进行鉴定的一种方法。该方法主要包括海南种植鉴定和正季种植鉴定[5],是目前公认比较可靠、直观的杂交稻种子纯度鉴定方法之一。但是在种植环境条件发生改变的影响下,植株的形态特征和生物学特征可能会出现改变,导致假杂种与真杂种间难以区分,从而使得结果失真[6],并且该方法会因为成本和时间的限制,而仅选取一定数量的样品进行检测,从而产生误差。

  1.2.1.2其他传统杂交稻种子纯度鉴定方法

  除上述田间小区种植鉴定法之外,还有形态鉴定法、幼苗鉴定法、苯酚染色法和近红外光谱法等。这些传统的杂交稻种子纯度鉴定方法都是通过基础的实验操作或直接观察杂交稻种子的特异性形态特征来进行鉴定,是杂交稻种子纯度鉴定方法中最简单、最基础的[5],相应的它们可快速、方便地鉴定杂交稻种子纯度。但是对于亲缘关系相近的品种,这些方法具有应用范围窄以及可靠性差等弊端。

  1.2.2现代杂交稻种子纯度鉴定方法

  随着现代科技的发展,生物化学、分子生物学等手段也渐渐开始在杂交稻种子纯度鉴定上运用,如:DNA分子标记鉴定法、蛋白质电泳法等。这些方法不受季节和环境的限制,在生物体的各个组织或者各个发育阶段均可检测[7],但对实验条件、设备等各个方面都有较高要求,导致杂交稻纯度检测成本提高且可行性差。

  1.2.3设计育种杂交稻种子纯度鉴定方法

  设计育种鉴定法是遗传和育种家通过探索杂交稻在苗期所具有的标记性状进行设计育种,通过特有的形态特征或生物学特性对假杂种进行快速筛选,实现杂交稻纯度快速准确的鉴定[8]。目前,杂交稻设计育种鉴定法主要包含除草剂标记鉴定法、叶色标记法和芽鞘紫线法[3],这些方法可以在杂交稻苗期通过标记性状进行快速准确的判断。但是要实现这些方法需要对杂交稻亲本进行育种改良,使两系或者三系中的不育系携带有易于识别的隐性性状,且隐性性状不能影响到农艺性状,因此加大了设计育种的难度。

  除草剂鉴定法主要利用苯达松抗性基因Bel和除草剂抗性基因Bar进行育种,以进行杂交稻种子纯度鉴定。张集文等[9]利用辐射诱变筛选出苯达松敏感致死标记的突变植株,选育为水稻两用不育系8077S,最终表现为假杂种对苯达松敏感,而真杂种对苯达松不敏感,因此只需将杂交种子播种至长出绿叶时,用一定的浓度苯达松溶液喷洒进行筛选,即可准确识别真假杂种。此外,黄大年等[10]则是利用Bar基因为植株提供了除草剂Basta的抗性这一特性,将Bar基因导入到水稻三系或两系的恢复系品种中,通过育种手段,使得真杂种对除草剂不敏感,而假杂交稻和杂草对除草剂敏感而被杀死。除草剂鉴定法能进行快速地进行鉴定真假杂种植株的同时,也能直接提高杂交稻种子纯度。但是,这一鉴定过程需要使用到除草剂这类化学药品,因此必须考虑除草剂到对环境的影响。

  叶色鉴定法可针对在两系或三系杂交稻中育性不稳定的不育系导入易于识别的叶色标记基因,通过特殊的叶色识别鉴定,以快速进行杂交种纯度鉴定。因为叶色的多样性而出现了多种鉴定法,例如:淡绿色叶色标记、紫色叶色标记和白化转绿标记。宋克堡[11]等在试验田中发现了水稻叶片为淡黄叶的隐性突变体,并育成一系列淡黄叶两系不育系安农标810S。舒庆尧等[12]利用辐射诱变龙特甫B,培育出全龙A白化转绿型叶色标记不育系。而紫叶水稻材料因为温敏性过强、配合力不理想以及稻米品质较差等多种因素,所以目前大多数紫叶水稻材料还未能在生产上大面积推广应用[3]。

  此外,相较于叶色法,芽鞘紫线法在水稻种子发芽3 d后通过紫线就可以来区分真假杂种,区分杂交种中混有的不育系、恢复系等无紫线的种子,从而实现纯度的极早期鉴定。

  1.3芽鞘紫线的研究历程

  胚芽鞘是单子叶植物所特有,特别是禾本科植物胚芽外的锥形套状物,是一个鞘状结构,是种子萌发后可以被观察到的第一个器官[8]。水稻芽鞘紫线是芽鞘上两条由芽鞘尖端向其基部延伸的紫红色射线水稻[13],是水稻种子萌发后能观察到的最早期性状。由于这一特性,水稻芽鞘紫线这一性状受到国内外许多学者的注意。

  1.3.1国外研究

  国外对芽鞘紫线的研究要早于国内,主要集中研究其遗传特性。印度学者的Dhulappanava C.V.等[14,15]通过观察由T-160(芽鞘无紫线)和AC-177(芽鞘紫线)配置的F2群体中紫线对无紫线的性状分离比(195:61),认为该性状受2个显性重叠基因Pc1、Pc2和1个显性抑制基因I-Pc、1个显性反抑制基因Ai-Pc共4个基因控制;而印度学者Rao U.P.等[16,17]认为该性状受2个显性互补基因Pc-1、Pc-2控制,与褐飞虱抗性连锁。Maekeawa M[18]学者提出了C、A、P基因和一个偶尔参与的抑制基因以解释水稻的色素遗传。

  1.3.2国内研究

  国内对芽鞘紫线的研究主要集中于将其应用于杂交稻种子纯度鉴定的方法上。1985年,沈又佳、陆作楣[19]提出“平板发芽芽鞘色鉴别法”来快速鉴别出“赣化二号”IR24,以解决常用的“海南种植鉴定法”成本高或者“酯酶同功酶聚丙烯酰胺凝胶电泳法”技术性强、设备复杂等问题。但是,因为“赣化二号”杂交稻父本本身具有紫线性状,所以若仅凭芽鞘上是否具有紫线这一性状是不能将“赣化二号”杂交稻和其父本区分开。1998年,席建民[13]重新发现了芽鞘紫线并对这一性状做出了较为详细的解释。席建民[13]通过对5个不同的杂交组合(母本均表现为有紫线、父本表现为无紫线)进行遗传分析后发现:F1均表现出紫线,F2紫线:无紫线分离比有9:7、15:1、63:1、3:14共4种类型,认为芽鞘紫线的性状表现受多对基因控制。2004年,张毅等[20]通过配制大量的杂交组合,连续4季的跟踪研究,获得大量的F1代、F2代和BF1代紫线性状的分离情况比例,结合前人对芽鞘及其它器官色素遗传的研究,提出了C_A_P_I_Ai(t)_模型,假设芽鞘紫线受3个独立的显性主效基因C(色素原基因)、A(色素原转化基因)和P(表现部位基因),以及1个显性抑制基因I和一个反抑制基因Ai(t)的控制,芽鞘紫线的表达三个显性主效基因缺一不可,I具有抑制P的作用,而Ai(t)抑制I的作用[21]。随后,张毅等[22]还发现了“双亲芽鞘无紫线但其F1有紫线”的现象,认为该现象是由OsAi和OsC1两对基因控制,两者分别为玉米R/B和Pl/C1基因的同源基因,在水稻中互补控制芽鞘紫线的表现,其中,OsAi基因的表达仅限于芽鞘上;同时,还提出选育OsAi基因为隐性的芽鞘无紫线而其它器官有紫色的不育系和OsC1基因为隐性的芽鞘无紫线且其它器官无紫色的恢复系,实现双亲互补。基于“生产的种子中真杂种必然明显地表现紫线,假杂株必然明显无紫线”这一理论实现经济、快速、准确的杂交种纯度鉴定。

  1.4本研究目的与意义

  利用杂交稻在苗期所具有的标记性状进行设计育种,已经在除草剂鉴定法和叶色鉴定法看到一定的成效,而芽鞘紫线同样作为苗期所具备的标记性状以及种子萌发后所能观察到的最早期性状,它在杂交稻种子纯度鉴定的运用上也具有明显的优势。因此,本研究在课题组前期对芽鞘紫线的遗传分析和一个相关基因(OsAi)的初步定位的基础之上,拟对课题组利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Ⅱ-32B中与芽鞘色素合成相关的OsAi基因而制成31个的基因敲除材料和1个野生型水稻材料(籼稻II-32B),通过测序分析鉴定OsAi基因突变是否发生及其具体突变结果,以期为后续芽鞘无紫线不育系的选育提供遗传材料和参考。

  2.材料与方法

  2.1材料

  2.1.1植物材料

  野生型水稻材料1个:籼稻II-32B

  OsAi基因敲除材料31个:编号为A1-A31,由本课题组前期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除籼稻Ⅱ-32B的OsAi基因获得。

  2.1.2引物

  转基因检测引物:HyF1/HyR1,产物为500 bp,该引物为一对潮霉素抗性基因引物,用以检测是否具有转基因成分,由上海捷瑞合成。

  突变检测引物:AiCSF2/AiCSR2,产物为413-700 bp,分别带有EcoRⅠ和KpnⅠ位点,由上海捷瑞合成。

  表1引物序列表

  Table 1 Primers sequence

  引物名称引物序列长度

  转基因检测引物HyF1:ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC 25

  HyR1:TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA 25

  突变检测引物AiCSF2:CGGAATTCCCGTCCGGCCTTGATCAAAT 28

  AiCSR2:GGGGTACCGATCAGTCGTCATCGTCGCC 28

  2.1.3菌种和质粒

  大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α由云南大学农学院实验室保存,pUC57载体购自大连TaKaRa生物工程有限公司

  2.1.3主要仪器设备

  YC-980L冷藏柜(中科美菱低温技股份有限公司)

  SHZ-B水浴恒温振荡器(上海博迅生物仪器股份有限公司)

  GI80TR高温压灭菌锅(ZEALWAY公司)

  SW-CJ-2FD双人超净工作台(上海博迅实业有限公司)

  Sartorius arium bagtank 50超纯水仪(德国赛多利斯仪器系统有限公司)

  生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)

  BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)

  DW88L626超低温保存箱(海尔集团)

  transferpette移液枪(德国普兰德公司)

  凝胶成像仪(赛默飞世尔科技有限公司)

  PCR扩增仪(Biomoetra公司)

  恒温培养箱(上海恒一科学仪器有限公司)

  台式高速离心机(Eppecdorf公司)

  制冰机(格兰特制冷设备制造有限公司)

  电泳仪(北京六一仪器厂)

  天根TGem Plus全波长分光光度计(天根生化科技有限公司)

  2.1.4主要试剂及溶液配制

  LB培养基:酵母膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,蒸馏水1000 mL。

  普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化生化科技有限公司,DNA产物纯化试剂盒购自全式金生物技术有限公司,高保真Taq酶、一般Taq酶、5×GC Buffer、dNTPs等均购自Takara宝生物工程(大连)有限公司、β-巯基乙醇,无水乙醇,CTAB、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂、Gold View核酸染料贮存液等其他化学试剂均为国产分析纯。

  2.2方法

  2.2.1 DNA提取

  供试水稻材料采用改进的CTAB法提取DNA:

  (1)CTAB抽提液在65℃下进行预热。

  (2)0.4 g左右的水稻材料叶片用液氮磨成粉末,迅速用小勺或蓝色枪头转入准备好的2.0 mL离心管中。马上加入750μL 2%的CTAB抽提液及15μLβ-巯基乙醇混匀,然后置于浮漂上65℃水浴45 min,中间间隔颠倒混匀4-5次。

  (3)水浴结束后,取出浮漂,静置待冷却,其后加入与上清液等体积(约750μL)的氯仿/异戊醇(24:1)混合液,置于振荡器中混匀15 min,使之乳化。

  (4)10000 rpm室温离心10 min。

  (5)充分吸取上清液于已备好的1.5 mL离心管中,注意不要破坏中间蛋白相。

  (6)加入与上清液等体积的-20℃预冷的异丙醇,立即轻柔颠倒混匀,出现白色絮状沉淀。

  (7)用剪大口径的蓝色枪头吸住沉淀转移至1 mL 75%乙醇的离心管中漂洗,用黄枪头一边侧向挤压沉淀,一边吸干液体,如此漂洗2-3次。

  (8)弃上清液,加入1 mL无水乙醇,漂洗1-3 min。

  (9)吸干乙醇后干燥沉淀,并用200μL ddH2O溶解沉淀,即得到DNA粗提物,存于-20℃备用。

  2.2.2筛选无转基因成分的单株

  利用HyF1/HyR1转基因检测引物,采用一般Taq酶对供试材料DNA进行PCR扩增。

  PCR扩增反应采用12.5μl的反应体系:其中ddH2O 8.125μL、2.5mM dNTPs 1μL、10×Taq Buffer 1.25μL、DNA 1μL、引物各加入0.5μL、一般Taq酶25μL,低速离心15 sec,使体系充分混合均匀。

  PCR反应程序如下:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共设置30个循环,在72℃继续延伸5 min,25℃10 min。最后将PCR板取出放入4℃冰箱保存,待琼脂糖电泳检测。

  每个样分别取2μL PCR产物、3μL蒸馏水和1μL Gold View核酸染料贮存液加入泳道后,用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。通过琼脂糖凝胶上带型的有无,筛选出无转基因成分的单株。

  2.2.3目的片段扩增和产物回收

  对筛选出的无转基因成分单株,采用AiCSF2/AiCSR2突变测序引物,利用高保真Taq酶进行PCR目标产物扩增。

  以籼稻II-32B的DNA为模板,摸索AiCSF2/AiCSR2引物的最佳扩增条件(主要对退火温度和GC Buffer浓度的摸索),后续PCR扩增按最佳扩增条件进行。

  PCR反应体系为50μL:在0.2 mL离心管中加入DNA模板2μL(<200ng),5×GC Buffer 10μl,dNTP Mixture(2.5 mM each)4μl,10μmol/L引物各1.5μL,PrimeSTAR?Max DNA Polymerase(5 U/μl)0.5μl,再加入双蒸水补足至50μL。最后将其分装在两个PCR孔中。低速离心15 sec,使体系充分混合均匀

  PCR反应程序如下:94℃预变性1 min,98℃变性10 s,水稻材料最佳退火下进行15 s,72℃延伸10 s,共设置32个循环,在72℃继续延伸5 min,25℃10 min。最后将PCR板取出放入4℃冰箱保存,留待琼脂糖电泳检测。

  每个样分别取2μL DNA、3μL蒸馏水和1μL Gold View核酸染料贮存液进入泳道后,用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。选取在413-700 bp之间有清晰条带的PCR产物,利用DNA产物纯化试剂盒将其进行产物回收。最后用天根TGem Plus全波长分光光度计在260 nm和280 nm下测定DNA纯化产物的OD值,检测其浓度及质量。

  2.2.4目的片段克隆与质粒抽提

  (1)采用限制性内切酶EcoRⅠ/KpnⅠ,对纯化产物和质粒pUC57在2个0.2 mL离心管中分别进行双酶切。

  双酶切反应体系为30 mL:其中纯化产物/质粒2μg(根据纯化产物/质粒浓度计算所需用量)、EcoRⅠ1μL、KpnⅠ1μL、10×Buffer 3μL,最后加双蒸水补足至30μl。将反应体系放置于37℃恒温箱中30 min,之后用1%的琼脂糖电泳进行检测,利用天根普通琼脂凝胶试剂盒将酶切产物进行回收。

  (2)利用T4 DNA连接酶制成连接反应液,将目的片段基因与质粒载体骨架在0.2 mL离心管中进行连接。

  连接反应液配比如下:10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、OsAi基因片段0.2 pmol、质粒PUC57载体骨架0.02 pmol、T4 DNA Ligase 0.5μL、最后加双蒸水补足至10μL(注:目的基因DNA的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍;摩尔数与质量:1μg 1000 bp DNA=1.52 pmol,1μg pUC57 DNA(2720 bp)=0.57 pmol。本实验目的片段413-700 bp,骨架大约2700 bp)。将连接反应液在22℃恒温培养箱中放置30 min。

  (3)质粒抽提

  取用10μL连接产物加入到25μL DH5α感受态,冰水浴30 min,再42℃水浴热激45 s,最后迅速放冰水浴2 min;之后将体系加入900μL不含Amp抗生素的LB液体培养基中,在37℃恒温振荡器中复苏培养60-90 min;复苏结束后,在5000 rpm室温离心5 min,弃去900μL上清,余下的100μL吸取均匀,使菌体重悬。吸取100μL菌液,均匀涂布至含有Amp抗生素的LB固体培养基上,在37℃恒温培养箱中倒置培养18-24 h至长出大小合适的菌落;

  等菌落直径平均长至2 mm左右大小时,每个单株挑取12个单克隆菌落分别接种于5 ml LB液体培养基(含Amp)中;之后将其放入恒温振荡摇床上,37℃、250 rpm培养约9 h至形成较浓的菌液备用。

  2.2.5将阳性单克隆菌液进行PCR检测和测序检测

  用AiCSF2/AiCSR2引物,对阳性单克隆菌液进行PCR检测。

  PCR扩增反应采用12.5μl的反应体系:其中ddH2O 8.125μL、2.5mM dNTPs 1μL、10×Taq Buffer 1.25μL、DNA 1μL、引物各加入0.5μL、一般Taq酶25μL,低速离心15 sec,使体系充分混合均匀。

  PCR反应程序如下:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共设置30个循环,在72℃继续延伸5 min,25℃10 min。最后将PCR板取出放入4℃冰箱保存,待琼脂糖电泳检测。

  每个样分别取2μL DNA、3μL蒸馏水和1μL Gold View核酸染料贮存液进入泳道后,用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。选取3-5个目标片段大小为413-700 bp的单克隆菌液进行测序检测,由生工生物工程(上海)股份有限公司Sangon Biotech(Shanghai)完成测序。

  3.结果分析

  3.1无转基因成分单株的筛选

  本实验采用转基因检测引物HyF1/HyR1对31个OsAi基因敲除材料进行目的片段扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出没有出现目的条带的单株,共获得12个无转基因成分的单株(图1,表2)。其中,因为A4、A5、A6来自于同一株系,故仅挑选其中之一进行后续实验。此外,考虑到实验目的是为尽可能的挑选出大片段缺失突变体,故在后续OsAi基因突变检测实验中增加A23单株。因此,最终选取A2、A5、A9、A12、A15、A18、A21、A23、A27、A29共10个单株,进行后续实验。

  图1无转基因成分单株筛选电泳结果图

  Fig 1 electrophoretic results of the detection of transgene free individuals

  表2无转基因成分检测结果

  Table 2 Screening results of transgene free

  编号转基因成分检测结果编号转基因成分检测结果

  A1+A17+

  A2-A18-

  A3+A19-

  A4-A20+

  A5-A21-

  A6-A22+

  A7+A23+

  A8+A24+

  A9-A25+

  A10-A26+

  A11+A27+

  A12-A28+

  A13+A29-

  A14+A30+

  A15-A31+

  A16+

  +表示结果为阳性,-表示结果为阴性

  3.2敲除突变测序结果分析

  为更准确地得到水稻芽鞘紫线OsAi基因敲除突变发生情况,对筛选出的10个单株进行测序检测。对上述材料DNA靶点区域先进行PCR扩增、产物回收和克隆,最后每个单株随机挑选3-5个克隆进行PCR检测和测序。利用Vector NTI进行序列比对(图2),结果表明:OsAi基因突变以缺失突变为主,包括发生大片段缺失、小片段缺失,以及形式多样的复杂突变。

  图2 OsAi基因水稻部分突变体序列比对分析

  Fig.2 sequence blast of some OsAi mutants

  首先,A5(-1、-5)、A9(-5)、A23(-1、-2)、A29(-6、-9)四个单株均在TTTCAGCTAGTCCCGACGGCGGAAG前出现了缺失297bp的大片段缺失突变;A15(-3)单株在TAGTCCCGACGGCGGAAGCTACT前出现了缺失154bp的大片段缺失;A21(-11)单株不但在TCAGCTAGTCCCGACGGCGGAA前出现了缺失297bp的大片段缺失,还在TAGGTTTCGGAGGACCCGGC前发生了A-G替换。

  其次,A12(-6)、A18(-12)两个单株均具有TCCCTGGTCGTGTTTTCAGCTAG前缺1bp的缺失突变,均缺失1bp的A碱基;A12(-4)、A21(-1、-12)两个单株均具有CCCTGGTCGTGTTTTCAG前缺7bp的小片段缺失突变。A12(-5)单株在CCTGGTCGTGTTTTCAG前缺3bp的小片段缺失突变;A29(-9)在TATTCGAATTAACAAACAAT前缺失1bp的A碱基。A27单株具有两种缺失突变,一种是A27(-2、-3、-5)在TATTCGAATTAACAAACAAT前缺失1bp的A碱基,且在CCCTGGTCGTGTTTTCAG前缺失5bp的小片段缺失突变,另一种是A27(-4)在TTTTCAGCTAGTCCC前有个G-C替换和缺失1bp碱基和复杂的插入替换。

  最后,根据测序结果可知,A5(-2)单株在GGTCGTGTTTTCAG前缺5bp的同时,在CTAGTCCCGACGGCG前也增加了19bp;A9(-2、-3、-4、-5)单株在GTCGTGTTTTCAGCTAGTC前既增加了14bp也替换了6bp(分析具体情况);A18(-8)单株在CCTGGTCGTGTTTTCAGCTAGT前缺3bp,且在TCACGCGGTAGCCGGCGGCG前发生了一个C-A替换。此外,A23(-11)单株在TGTTTTCAGCTAGTCCCGA前缺失14bp,且TGT变成TCT,TATTCGAATTAACAAACAATATT前缺失1bp的A碱基。

  与以上突变皆发生在靶位点的结果不同的是,在测序结果中,还检测到非靶位点出现了小片段的缺失突变。A5(-3)单株在非靶位点AGCTACTGACGTCGACGATGCC前出现了36bp的缺失;A2(-9、-10)单株在靶位点TATGGGATACGCCGCCCC前缺5bp,同时在非靶位点GCGGAAGCTACTGACGTCGACG前出现了36bp的缺失。

  4.讨论

  转基因技术虽然可以快速、有效地改良农作物产量和品质性状,然而人们现阶段对于转基因植物存在着众多争议。例如,在获得转基因植株后,科学家将不再需要利用抗性标记基因进行筛选,故而抗性标记基因就被认为是多余的东西。同时,因为大多数的标记基因是抗生素抗性基因,如:潮霉素抗性基因,因此,抗性标记基因的残留对环境和食品安全都具有潜在的不良影响[23]。而本实验材料是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除籼稻Ⅱ-32B的OsAi基因所得,因此本实验首先通过潮霉素抗性基因筛选出无转基因成分的单株,以便减少人们对转基因植物的忧虑,以及在后续育种实验中可以再次利用潮霉素抗性基因进行另一目的基因的遗传转化和筛选,同时也可避免编辑系统在后续世代中再次突变。

  实验中我们通过测序发现了多种突变方式,为后续不育系选育提供了遗传材料和参考。尤其,A5(-1、-5)、A9(-5)、A15(-3)、A21(-11)、A29(-6、-9)和A23(-1、-2)六个单株在靶位点出现了大片段的缺失突变,这种大片段缺失突变具有易于在后续育种过程中,与其他优良基因进行整合时进行分子标记检测的优势。

  在最后测序检测中,A2(-9、-10)和A5(-3)单株在非靶位点出现了缺失突变,可能与前期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行水稻OsAi基因敲除实验过程中脱靶突变有关。作为主流基因编辑工具,CRISPR/Cas9系统虽然在众多研究领域中取得了不错的成果[24],但是在实际应用过程中依然存在潜在的脱靶风险,主要与sgRNA与靶序列的结合以及Cas9对PAM序列的识别、其他诸如盐离子浓度等影响有关[25]。

  5.结论

  本实验通过利用潮霉素转基因检测引物筛选出的10个单株,进行DNA靶点区域的PCR扩增、产物回收和克隆,随机挑选部分克隆进行PCR检测和测序,最终发现OsAi基因出现了多种突变方式,基本以缺失突变为主。其中,A5(-1、-5)、A9(-5)、A15(-3)、A21(-11)、A29(-6、-9)和A23(-1、-2)六个单株在靶位点出现了大片段的缺失突变,可用于选育芽鞘无紫线的II-32B,进而通过回交获得OsAi基因为隐形的芽鞘无紫线II-32A,并配制出能够快速准确进行纯度鉴定的杂交稻组合。但是,由于在前期无转基因成分筛选过程中A23单株结果显示阳性,因此在利用A23(-1、-2)单株进行后续育种实验前应先进行转基因成分剔除实验。