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论文方法介绍-pH刺激响应的修饰环糊精超分子纳米粒子的构筑及其
时间:2021-04-19 13:53:38

  环糊精(Cyclodextrin,CD)及其衍生物具有一定尺寸的疏水空腔和亲水表面,能与难溶性药物形成超分子体系,使超分子包合物达到良好的亲水效果,从而提高药物的水溶性和生物利用度。同时,基于环糊精的刺激响应体已经成为超分子化学的研究热点,刺激响应组装体性能很容易受诸如pH、温度、光、磁场强度、还原性化合物、酶以及其他因素的控制使其能够实现智能调控组装体结构,实现药物的靶向释放、定时释放。

  本论文用两种修饰β-CDs构筑了两种对pH响应的超分子组装体,研究了超分子组装体的结构及性能。使用2,6-二甲基-β-CD(DM-β-CD)雷公藤内酯酮(TN)制备了固态包合物。具体内容如下:

  (1)使用带有负电荷的七取代磺基丁基醚β-CD(SBE7-β-CD)与带有正电荷的阳离子表面活性剂苄基十二烷基二甲基溴化铵(BDBAB)构筑了一种对pH响应的超分子纳米粒子。通过紫外可见光谱(UV-Vis)、zeta电位、动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)考察所构筑纳米粒子的组装/解组装行为。将所得超分子纳米粒子对模型药物DOX进行负载,采用TEM和UV-Vis进一步研究了负载药物后纳米粒子的pH响应释放行为。

  (2)采用合成的单-(6-五乙烯六胺)-β-CD,与带有负电荷的阴离子型表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)作为模块构筑了一种pH响应纳米粒子。通过UV-Vis、zeta电位、动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)考察所构筑的超分子纳米粒子的组装/解组装行为。进一步采用TEM和UV-Vis研究了纳米粒子对雷公藤红素和阿霉素的载药行为。

  (3)通过MTS实验研究了上述两种载药后的超分子纳米粒子的体外抗肿瘤活性、及其对正常细胞的抑制活性。

  (4)采用饱和水溶液法制备TN和DM-β-CD的固态包合物,使用UV-Vis,1H HMR,2D ROESY,FTIR,XRD和SEM研究了DM-β-CD对TN的包合行为。并研究了包合物的热稳定性、水溶性和体外释放度。

  1.1超分子化学概述

  1.1.1超分子化学发展简介

  传统化学研究主要关注化合物的共价键的断裂和形成,而在自然界中一些化合物之间并没有共价键但却结合在了一起。尤其是在生物体内例如抗原-抗体的相互作用,遗传物质脱氧核糖核酸,核糖核酸的转录与复制,酶-底物的相互作用等[1]。这些非共价键相互作用力一直没有被人充分的认知与利用,直到超分子化学的概念被提出。超分子化学具有划时代的意义,有别于传统化学研究,它主要研究的是分子之间非共价作用力如氢键、范德华力、疏水作用、偶极-偶极相互作用、电荷-偶极相互作用、静电相互作用、π-π堆叠等弱的相互作用力[2-4]。

  1967年美国杜邦公司C.J Pederson等第一次发现了冠醚(二苯并-18-冠醚-6:Dibenzo-18-Crown-6)[5]。D.J Cram和J.M Lehn在Pedersen工作的启发下,也开始了对冠醚的研究。于1978年法国化学家J.M Lehn最早提出了超分子化学的概念[6]。1987年诺贝尔化学奖授予Pedersen、Lehn和Cram三位化学家,以表彰他们在超分子化学理论方面的开创性工作。这标志着超分子化学进入了一个新的时代,被越来越多的人认识到超分子化学的重要性,进入了一个快速发展时期。大量的的专业学术著作被发表在专业的学术期刊上,使得越来越多的人关注到这一领域[7]。而随着研究的深入,人们发现分子化学合成中共价键的形成与断裂受到能垒的约束,使得反应条件苛刻,而超分子化学中的分子间动态可逆的相互作用具有反应快速、可逆、条件温和等特点[8,9]。超分子化学的出现不仅为基础科学的研究提出了一种新的思路,而且在医疗食品加工等与我们生活息息相通领域具有广泛的运用。

  1.1.2基于大环化合物的分子识别与组装

  在超分子化学领域中,人们越来越关注大环化合物的潜在应用。这些大环具有刚性结构和,更重要的是其环状空腔可以在溶液和固态下结合各种无机/有机/生物分子和离子,因此其作为优秀受体不仅被广泛用于分子识别中,同时也是构建纳米结构功能材料的重要模块[10]。基于分子识别,合理设计受体与配体,就可以进行自组装形成更大尺度的二维或三维结构大环超分子组装体[11-13]。近年来除了传统的三种大环化合物:冠醚,环糊精(CD)和杯芳烃外,越来越多的具有各种特定功能的大环化合物被发现并成功合成出来[14]。卟啉,酞菁,杯芳烃,柱芳烃,葫芦脲因他们新颖的结构,独特的性质引发了人们对他们浓厚的研究兴趣。此后基于上述大环受体的超分子组装体也被陆续报道。大环超分子组装体系具有一系列优异的特性[15-16]。首先,与传统组装体相比其不需要大量有机溶剂,反应时间更快,反应条件温和,不需要特殊仪器且对环境更友好。大环超分子组装体可以通过简便方法制备:在溶液中混合大环化合物和模型底物组分,通过几种分子间非共价相互作用(例如:范德华力,疏水,氢键和静电相互作用)实现超分子组装体构筑。其次大环超分子系统通常带有一个以上的官能团,这些官能团可以同时与所容纳的底物相互作用,这有望通过整合效应改善组装体的性能。到目前为止,已有许多可控大环超分子组装体的研究被报导[17-20]

  图1.1基于柱芳烃的超分子囊泡[21]

  Wang等将两种抗癌药物喜树碱和苯丁酸氮芥通过二硫键成功地连接在一起,从而获得了新型的药物-药物共轭药物前体。这种药物前体与两种抗肿瘤药物相比对正常细胞的毒性更低[21]。采用水溶性支柱[6]芳烃为主体分子,与药物前体形成了超分子主体-客体包合物。该包合物可以在水溶液中进一步自组装成超分子囊泡。由于肿瘤细胞中谷胱甘肽(GSH)的过量表达会导致前药中二硫键的破坏,从而使超分子纳米组装体被破坏从而释放出抗肿瘤药物。至此他们构筑了一种基于GSH响应的超分子组装体,为可控药物运输系统提供了一种潜在的设计方案。

  Liu等通过偶氮苯桥联全甲基-β-CD与卟啉自组装构建了光敏感的超分子纳米管-纳米粒子系统[22]。研究表明,偶氮苯常态下反式结构更为稳定,而使用365nm紫外光照射后,其结构由反式迅速变为顺式,当用白光照射或置于黑暗条件时又会恢复到反式结构。故这些纳米管和纳米粒子能够在365nm紫外光的照射下转换为球形,将其置于特征吸收波长450nm的环境下又变回管状。这种光控形态转换可逆且可循环使用数十次。这为构建可智能控制有序纳米结构的形态提供一种可行且方便的方法。

  Zhang等利用紫精、偶氮苯和葫芦[8]脲作为光响应控制模块构筑了一种载药系统[23]。葫芦[8]脲的空腔可同时包合一个反式偶氮苯分子和一个紫精分子,当偶氮苯分子构型由反式变为顺式时就会从葫芦[8]脲空腔中脱出。他们设计了一种带有特定序列肽链的紫精分子,先将偶氮苯修饰在介孔二氧化硅纳米粒子上,再将药物包埋入纳米粒子中。二者在水溶液中自组装在介孔纳米粒子表面形成包合物阻止药物释放。当用365nm紫外光照射后纳米粒子表面的的包合物被破坏药物得以释放。

  此外,许多基于大环超分子组装体的可控系统被报道,包括可以采用溶剂[24]、氧化还原[25,26]、酸/碱[27]等智能控制的分子机器和开关[28,29],荧光化学传感器[30,31]和荧光凝胶[32]等。这些组装体拥有更加多样化的功能,更加简便的构筑,优良的改性能力,充分体现了由非共价相互作用代替共价键的优势,成为化学、材料学、生物学等相关领域研究的热点。

  但是,由于许多重要的生物过程主要发生在水性环境中,因此许多大环化合物由于相对较低的水溶性大大限制了它们在许多领域的应用,尤其是在生物领域中。因此,研究者为可控制的水溶性大环超分子体系的构建及其应用做出了许多努力。

  1.2基于环糊精的分子识别与组装

  1.2.1环糊精介绍

  环糊精(cyclodextrins,CDs)于1891年被villiers从在淀粉发酵后的降解物中偶然的发现[33]。CD由未扭曲的椅式结构的D-吡喃葡萄糖单元以α-1,4-糖苷键首尾连接形成,这使得整个分子呈一种截锥状结构。常见的天然CD为α,β,γ-CD他们分别含有6,7,8个D-吡喃葡萄糖单元,这导致了他们在溶解度,旋光性等一些性质上有差异。表1.1列出三种天然CD的部分基本性质[34]。

  表1α,β,γ-CD的部分基本性质

  CD类型αβγ

  葡萄糖单元个数6 7 8

  相对分子质量972 1135 1297

  水中溶解度14.5g/100mL 1.85g/100mL 23.2g/100mL

  空腔直径0.47~0.53 0.60~0.65 0.75~0.83

  空腔高度0.79±0.01 0.79±0.01 0.79±0.01

  空腔容积0.174 0.262 0.427

  在水中晶型六边形片状单斜的平行四边形棱柱

  α-淀粉酶对其水解情况可忽略慢快

  CD是一类较易得到的化合物,其造价低廉以β-CD为例,其每千克价格仅几美元。其化学性质稳定,可以通过控制反应条件对其进行选择性修饰。CD具有亲水的表面和疏水的空腔,这一特殊结构为其与各种底物模型结合提供了条件,在底物分子进入CD后其物理及化学性质在特定条件下会发生改变。CD具有良好的生物相容性,其水溶性好,无毒,可以在生物体内自然降解。在过去的120年发展中,尤其是自1980年以来取得的飞速发展,大量的先驱和杰出人物在这种引人入胜的分子的历史上留下了自己的印记,并极大地促进了其在工业的几乎所有方面的实际应用。几十年来,由于它们对水溶液和固态中各种有机和生物活性底物的优异分子结合能力,基于CD的分子识别和组装一直是超分子化学学术界的关注焦点。

  1.2.2基于CD的分子识别

  分子识别是指主体(受体)与客体(底物)选择性键合和配位,以实现某些特定的功能。这种键合与配合并不是依靠共价键作用力,而是分子之间的多种非共价键作用力协同作用的结果。CD由于其优异的性质,一直是分子识别方面的研究热点。在水溶液中,水分子容易进入CD的非极性空腔中,由于这种极性非极性的相互作用能量较高不容易稳定存在。在合适的非极性分子加入到溶液中后,水分子就会被取代,形成能量更低的相互作用组合,形成超分子配合物。除了疏水/亲水作用,这一过程还涉及到π-π堆积、氢键、静电作用、范德华力及其他一些非共价键作用力。这一过程与人体内抗体-抗原和蛋白质的产生等相互作用类似。迄今为止,CD及其衍生物对各种客体的分子识别机制研究已经非常深入,被广泛地运用于医药等各个邻域[35]。

  1.2.3基于CD的分子组装

  生命体中存在着各种各样对生命体的功能起着重要的作用的生物自组装,其通常能提供高度有序的微环境并具有特殊的结构,比如酶和细胞膜等就是生命体在长期进化过程中存留下来的生物组装体的典型范例。在众多大环受体中,CD因无毒,良好的生物相容性和水溶性等优良性质,从而被认为是构建刺激响应性超分子组装体的最有用的结构单元之一。通常将刺激反应位点以共价或非共价方式引入CD结构中,是一种将智能响应性能赋予刚性大环受体的可行方法。CD的自组装可以衍生出许多具有独特拓扑特征的分子级纳米结构,例如链烷、(假)轮烷、超分子聚合物、交联的水凝胶和网络以及功能化的纳米粒子,极大地扩展了超分子化学的研究目标。

  其中超两亲分子可以自组装为囊泡和粒子等形态,它的亲水部分与疏水部分通过非共价相互作用可逆地结合在一起[36],能够随超两亲分子的形成或解散动态响应微环境的变化,这种特性与生物体的自然生理过程类似。这提供了一种有效的方式来模仿自然和生理过程的响应,为用于生物智能材料的设计提供了一种潜在的方法。这些刺激响应条件主要包括光调控、pH值、温度、氧化还原和酶等。

  用于生物医学领域pH响应超分子组装体一直是超分子化学的研究热点[37]。Liu等使用壳聚糖和磺基-β-CD构筑了一种pH响应的超分子组装体[38]。如图1.4所示它在pH=5.3时壳聚糖和SCD由于电荷吸引作用形成一种逐层结构的纳米粒子。当pH调制10.4时,随壳聚糖质子化程度的降低导致纳米粒子解离。这种纳米粒子具有良好的稳定性,且对传统中药盐酸小檗碱有良好的负载/释放能力。该纳米粒子可在诸如胃的低pH环境中以稳定负载小檗碱,但是当运送至诸如肠一类的高pH环境中时可以释放小檗碱。壳聚糖与SCD都具有良好的生物相容性,使这种纳米粒子具有成为医用药物运输载体的潜力。

  考虑到在细胞内/细胞外环境中广泛分布着不同电荷和氧化还原状态,大量的研究人员致力于研究具有氧化还原敏感性基团的生物相容性纳米组装,以刺激对特定部位的反应。具有还原敏感性的二硫键和电活性二茂铁经常用于构筑基于CD的氧化还原刺激性超分子组装体。生物内部含有还原硫醇试剂例如谷胱甘肽(GSH),在其存在的情况下,二硫键可以裂解成游离硫醇,从而实现有针对性地在所需位置释放药物[39]。而二茂铁可以在氧化和还原过程中和β-CD形成包合物或者从β-CD空腔中排出,从而达到响应刺激调控组装体结构的目的。Xu等构筑了一种具有氧化还原刺激响应性的超分子组装体[40]。其使用三甘醇将二茂铁与α-CD连接在一起得到一种CD衍生物。这种衍生物能够在水中自组装得到一种囊泡结构的体系。这种衍生物在被氧化后由于衍生物中二茂铁基团带上了正电荷相互排斥,导致原先有序排列的结构被破坏使得囊泡解离。氧化后的衍生物分子被还原后,又能够变回囊泡形态。

  酶在人的生命过程中扮演着重要的角色,因此构筑酶响应的生物相容纳米组装体得到了广泛的研究。CD广泛用于各种领域,且与人体相容性好无毒易水解是构建纳米组装体的理想材料。将酶反应位点引入到CD的超分子组装体中,与疾病相关的特定酶可以用作诊断和治疗目标的理想靶标。Han等成功构筑了一种酶响应的超分子纳米粒子[41]。他们合成了带有负电荷的七羧基修饰的CD,用其诱导肉豆蔻酰基氯化胆碱聚集得到了一种囊泡形态的组装体。其对乙酰胆碱酯酶具有特异性响应,在加入乙酰胆碱酯酶后,肉豆蔻酰基胆碱分解为肉豆蔻酸和胆碱导致组装体分解。他们使用8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐作为模型药物进行负载,发现该组装体对带有正电荷的模型底物具有良好的负载能力和刺激响应释放能力。Hou等通过非共价键作用力采用磺酸化CD和鱼精蛋白构建了一种酶响应的超分子纳米粒子[42]。这种粒子具有良好的稳定性及药物负载能力。在加入胰蛋白酶后,纳米粒子中的鱼精蛋白特异性响应分解导致纳米粒子消失。由于其胰蛋白酶触发的分解行为,该纳米粒子可以受控方式有效地释放封装的药物模型。

  1.3环糊精及其衍生物在药物中的应用

  CD独特的结构使其能够选择性地键合各种客体分子。在药物研究中,β-CD及其衍生物因为其几乎无毒的特性被广泛运用[42]。由于其具有耐热、耐碱、不易被酶分解而且低毒等特点,与药物包合后能改善药物的水溶解性能,促进药物吸收和提高药物的生物利用度,提高药物稳定性,掩盖药物的不良气味和味道、降低刺激性和减轻毒副作用,将液态药物粉末化,防止药物相互作用[43,44]等。

  虫草素(COR)是我国传统中药冬虫夏草的有效成分。具有抗肿瘤、抗真菌、抑制微生物生长、抗炎、降血糖、抗动脉粥样硬化等多种药用功效。赵芳等[45]使用羟丙基-β-CD(HP-β-CD)与其制备了一种包合物(图1.7)。使得其溶解度提高到39.6倍,分解温度提高了60℃。改善了COR的水溶性和稳定性。

  图1.7虫草素与羟丙基-β-CD超分子体系的包合模式[45]

  香芹酚是一种衍生自百里香油的酚类单萜,其良好的抗癌活性引起了广泛的关注。Gabriela等使用β-CD与香芹酚制备了一种包合物[46]。形成包合物后,香芹酚水溶性提高了500倍。此外由于水溶性提高,这种包合物对前列腺癌的细胞毒性得到了显著的提高。

  图18香芹酚与β-CD的包合物[46]

  近期我们课题组[47]采用饱和水溶液法制备了包括花旗松素(TFL),槲皮素(QCT)和桑色素水合物(MH)在内的三种黄酮类化合物与丙二胺桥联-β-CD(DP-bis-β-CD)的包合物。形成包合物后,TFL,QCT和MH的水溶解度增加70-102倍。此外TFL和MH的包合物抗氧化活性均高于游离药物。这种令人满意的水溶性和高抗氧化活性使其作为草药或保健产品有潜在应用。

  图1.9三种黄酮类化合物与丙二胺-β-bis-CD的包合物[47]

  1.4本选题的意义及主要内容

  细胞、体液和器官都有自己的特征pH值以维持酸碱平衡。异常的pH值是一种生理机能障碍和疾病的表现。在肿瘤环境中,因为氧气和养分的缺乏导致细胞酸性代谢产物过量生成,使得肿瘤环境的pH值(≈6.8)略低于正常组织的pH值(≈7.4),且细胞内溶酶体和内含体的pH值会分别降低到6.0和5.5左右。易受酸性影响的CD超分子纳米组装体在正常环境稳定存在,而在酸性环境中易分解,这一特性使我们能够构建对pH敏感的CD超分子组装体,通过正常细胞和肿瘤细胞的pH值不同,使得药物能够在人体中实现定位释放于预期部位。此外在人体中各个器官的pH也不完全相同,如胃(pH≈2.0)和肠(pH≈10.4),故pH值变化范围广的超分子纳米装体可为药物在不同器官中的递送提供一种理论模型。

  CD及其衍生物具有亲水表面和一定尺寸的疏水空腔,并且由于引入了修饰集团使得CD的理化性质得到改良,并且能够引入带有电荷的基团用于构筑纳米尺寸组装体。通过静电作用带有电荷的CD与电性相反的客体如带正电荷表面活性剂、聚醚胺和壳聚糖等形成纳米粒子。并且由于构筑模块的粒子型结构,使得他们的质子化程度易受pH的影响。通过调节pH能够调控这种构筑的组装体的形成和解离,从而达到pH刺激响应的效果。SBE7-β-CD由于其在CD的边臂上引入带有负电荷的磺丁基增强了其对含氮类药物的结合能力,极大地提高了水溶性,并且引入了带有负电荷的基团。这让它能够通过静电作用里吸引带有正电荷的客体,从而构筑纳米组装体。多胺修饰β-CD由于在CD的边臂上引入“N”原子,一方面可以增加CD的水溶性和识别位点,同时在一定酸度下会使得CD边臂质子化而带上正电荷。这使得其可通过静电作用与带有负电荷的客体构筑纳米组装体。因此本文使用这两种CD作为构筑模块进行纳米纳米组装体的构筑。

  雷公藤内酯酮(Triptonide,TN)为卫矛科雷公藤中分离出来的一种环氧二萜内酯化合物,是雷公藤的主要有效成分之一.其具有良好的抗肿瘤活性但其较低的水溶性限制了其应用。2,6-二甲基-β-CD(DM-β-CD)是一种安全性好的药用辅料,其低价易得、水溶性较好、低毒性在药学领域被广泛应用。

  主要工作如下

  (1)使用带有负电荷的七取代磺基丁基醚β-CD(SBE7-β-CD)与带有正电荷的阳离子表面活性剂苄基十二烷基二甲基溴化铵(BDBAB)构筑了pH响应的超分子纳米粒子。通过紫外可见光谱(UV-Vis),zeta电位,动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)考察构筑的纳米粒子的组装/解组装行为。将所得超分子纳米粒子进行模型药物DOX负载,并通过TEM和UV-Vis研究负载药物后的纳米粒子形貌及pH刺激响应释放行为。

  (2)以合成的单-(6-五乙烯六胺)-β-CD,和带有负电荷的阴离子型表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)作为模块构筑具有pH响应性的纳米粒子。通过UV-Vis,zeta电位,动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)考察所构筑的超分子纳米粒子的组装/解组装行为。使用TEM和UV-Vis研究了纳米粒子的载药行为。

  (3)通过MTS实验研究上述两种载药超分子纳米粒子的体外抗肿瘤活性,及其对正常细胞的抑制活性。

  (4)采用饱和水溶液法制备TN和DM-β-CD的固态包合物,用紫外光谱滴定法研究DM-β-CD对TN的包合行为,进一步研究包合物的热稳定性、水溶性和体外释放度。

  第2章pH刺激响应的SBE7-β-CD/BDBAB超分子纳米粒子

  2.1引言

  近年来,刺激响应自组装受到了广泛的关注,因为它们在化学,生物材料和生物医学应用中有积极的应用。与传统组装体相比,超分子自组装体具有易于制备以及对多种刺激(包括光,温度,pH,氧化还原,酶和其他因素)的响应的优势[48-62]。几种非共价相互作用已被用于构建刺激响应性超分子自组装体,其中包括π-π相互作用,氢键,电荷转移,静电相互作用等[63-69]。研究表明,体液和器官都具有自己的特征pH值以维持酸碱平衡,这使得可以针对目标部位构建对特定pH敏感的超分子组装体。这种特定pH响应性纳米载体可以区分肿瘤细胞和健康细胞,从而有助于靶向药物递送,具有潜在的临床运用价值。目前为止已经有包括CD(CD)、柱芳烃和葫芦脲的几种大环受体被用于制备pH响应性超分子自组装体。

  Liang等人报道了基于磺化β-CD和聚醚亚胺的pH响应纳米粒子,它们在碱性环境中被破坏并且在酸性条件下回复为球形粒子[37]。Yang等人报道了基于介孔二氧化硅纳米豆和柱[6]芳烃的超分子系统,从而实现了肿瘤部分成像和pH响应的DOX释放[62]。Li等报道了一种基于N,N-二异丙基乙二胺连接的β-CD和金刚烷基封端的甲氧基聚乙二醇(mPEG-Ad)的纳米粒子,实现琥珀酸丁醇的pH响应释放[68]。Tuncel等报道了使用葫芦[7]脲作为构筑模块的纳米粒子,并实现了喜树碱的pH响应释放[18]。这些结果表明,超分子自组装体为构建用于生物体内的药物运输的pH刺激响应纳米粒子提供了一种潜在的思路。在这些大环受体中,CD具有多种优异的特性包括高水溶性、高生物相容性、价格低廉、明确结构以及易于进行化学修饰,这些特性使生物相容的CD超分子纳米粒子得以发展。

  在这项研究中,通过使用阴离子型的七取代磺基丁基醚-β-CD(SBE7-β-CD)和阳离子表面活性剂苄基十二烷基二甲基溴化铵(BDBAB)作为构筑模块,构建了基于静电相互作用的pH响应纳米粒子。SBE7-β-CD是一种带有7个阴离子臂的带负电荷的CD,其水溶性高、生物相容性高、低毒并且便宜[51]。BDBAB是一种两亲性阳离子表面活性剂,具有相对较高的临界聚集浓度。BDBAB/SBE7-β-CD纳米粒子的组装/解离行为是通过UV-Vis,zeta电位,动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)确定的。在SBE7-β-CD的帮助下,将BDBAB组装为超分子纳米粒子后,BDBAB的CAC值大大降低。值得注意的是,由于在不同的环境中BDBAB或SBE7-β-CD的质子化程度不同,BDBAB/SBE7-β-CD纳米粒子可以在降低pH值时分解,而且在将pH值提高到原始值后恢复到初始形态。同时,纳米粒子可通过有效地负载/释放模型药物物阿霉素(DOX)。

  2.2实验部分

  2.2.1材料

  SBE7-β-CD,分析纯(AR)购于上海韶远化学科技有限公司。三乙胺,分析纯(AR)购自Greagent-bate/通用试剂有限公司。DOX和BDBAB,分析纯(AR),均购自上海ADMAS试剂有限公司。上述药品均未进行进一步纯化直接使用。N,N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide,DMF),化学纯(CP)购自国药集团化学试剂公司使用前经过干燥处理。

  透析袋(截留分子量=3500 DA)购自美国联合碳化。实验中用水均为去离子水。

  2.2.2仪器

  METASH紫外-8000S分光光度计;Hitachi Hi-Tech F-7000荧光分光光度计;Malvern-Zetasizer nano ZS 90纳米粒径电位分析仪;JEM-1400F透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)

  2.2.3实验方法

  2.2.3.1紫外/可见光谱

  样品的紫外-可见光谱和透光率实验使用光程为10毫米的石英比色皿进行测试。

  2.2.3.2动态光散射(DLS)和zeta电位测量

  使用Malvern-Zetasizer nano ZS 90纳米粒径电位分析仪(英国马尔文有限公司)测定了样品的DLS和zeta电位值[52]。为了提供样品的平均粒径,该仪器使用了相位分析光散射,样品在纳米粒径电位分析仪上以90°的散射角进行检测。用去离子水作为zeta电位的背景电解质进行测量。

  2.2.3.3透射电子显微镜(TEM)

  取10μL制备好的样品溶液滴至300目碳支持膜铜网上,在空气中自然挥干即可。实验过程中所使用的加速电压为100 KeV。

  2.2.3.4载药纳米粒制备

  将13mg的BDBAB和11mg的SBE7-β-CD溶于100ml去离子水中,在25℃恒温(100rpm)下搅拌6h以保证组装完全,之后得到超分子纳米粒子溶液。准确称取3 mg DOX溶于10mL DMF,加入220μL三乙胺避光搅拌1h以除去DOX中的盐酸。之后将DOX溶液加入到纳米粒子溶液中。在25℃下搅拌(100转/分)下充分混合24小时后,通过超速离心10分钟去除未被包封的DOX(10000转/分),并在去离子水中透析24小时(分子截留量=3500 Da)纯化载药纳米粒子[50]。将部分载药纳米粒子溶液冷冻干燥以作进一步分析。

  2.2.3.5载药纳米粒子的pH刺激响应释放

  使用荧光发射光谱研究了载药纳米粒子的pH响应释放行为[53]。取2个洁净的透析袋(分子截留量=3500 Da),将50 mL载药纳米粒子溶液分别至入2个透析袋中。之后把装有载药纳米粒子的溶液分别加入到1000 mL pH=5.3和pH=7.2的缓冲溶液中,并在25℃下保持搅拌(100转/分)。每隔特定时间取出5mL缓冲溶液,并补充新鲜的缓冲溶液。取样结束后测量取出样品的荧光发射光谱,通过DOX的标准曲线计算药物累计释放率。

  2.3结果和讨论

  2.3.1 BDBAB/SBE7-β-CD超分子纳米粒子的构建

  BDBAB是一种阳离子型的表面活性剂,它具有疏水的尾端和亲水的氨基部分,在25℃下的临界聚集浓度(CAC)为5.6 mmol/L。如图2.1所示,在单独的0.35 mmol/L BDBAB溶液或是单独的0.05mmol/L SBE7-β-CD溶液中并没有丁达尔现象。而同样浓度的二者混合后却出现了明显的丁达尔效应,这说明二者混合的溶液中有组装体生成。

  图2.1丁达尔效应;左中右溶液分别为单独的七取代磺丁基醚-β-CD溶液(SBE7-β-CD:0.05 mmol/L),单独的十二烷基二甲基苄基溴化铵溶液(BDBAB:0.35mmol/L),七取代磺丁基醚-β-CD和十二烷基二甲基苄基溴化铵溶液溶液(SBE7-β-CD:0.05 mmol/L,BDBAB:0.35mmol/L)

  在SBE7-β-CD存在条件下BDBAB的临界聚集浓度(Critical Aggregation Concentration,CAC)的测定是通过固定SBE7-β-CD浓度,检测透光率曲线随着BDBAB加入出现的透光率改变得到的[54]。如图2.2 a所示,随着BDBAB浓度从0.075增加到0.275mmol/L,450nm处的光学透光率逐渐降低,这是由于大量聚集体形成的缘故。依据450nm透光率可以得到图2.2 b,可以发现拐点出现0.16mmol/L处,表明在SBE7-β-CD存在条件下的BDBAB的CAC测值为0.16mmol/L。这与单独BDBAB(5.6mmol/L)的相比,CAC降低了35倍。

  图2.2(a)在25°C时,固定SBE7-β-CD浓度为0.05 mmol/L,溶液在不同BDBAB浓度存在时的透光率曲线;(b)透光率在450nm处的值随着BDBAB浓度的改变而改变。

  在SBE7-β-CD诱导的自组装行为中,主客体之间可能发生了两种相互作用[55]。一种是SBE7-β-CD上拥有七个带负电的磺酸盐基团与客体BDBAB上的氨基正电荷之间的静电相互作用,另一个是SBE7-β-CD与表面活性剂BDBAB之间的主-客体包合作用。为了探明是哪一种作用力导致的这种诱导聚集现象,以天然β-CD为对照化合物,进一步研究了β-CD对客体BDBAB分子诱导聚集行为。如图2所示,在β-CD(0.05mmol/L)存在下,BDBAB溶液的光学透光率没有明显变化。由于β-CD拥有CD空腔,但边臂不带有电荷而没能诱导BDBAB聚集,故推测是静电作用力导致的SBE7-β-CD诱导BDBAB聚集。

  图2.3(a)固定β-CD浓度为0.05 mmol/L,溶液在不同BDBAB浓度存在时在25°C下的透光率曲线(b)透光率在450nm处的值随着BDBAB浓度的改变而改变。

  根据报道β-CD的空腔对金刚烷具有很强的键合能力,其稳定常数可达×10-5这一级别[56]。此处在0.05mol/L SBE7-β-CD和0.25mol/L BDBAB的溶液中加入0.05mol/L金刚烷。如图2.4所示在加入金刚烷前后溶液的透光率基本没有变化,表明加入金刚烷后虽然其占据了CD的空腔,但并没有导致纳米粒子的解离。这也进一步证明了了SBE7-β-CD诱导BDBAB聚集并不是由于二者形成主-客体包合物,而是由于静电作用导致的。

  图2.4加入金刚烷前后纳米粒子溶液透光率变化

  尽管SBE7-β-CD在一定浓度范围都能有效地诱导BDBAB的聚集,但确定SBE7-β-CD与BDBAB的最佳混合摩尔比是必要的[57,58]。为确定最佳摩尔混合比,固定BDBAB浓度为0.2 mmol/L,检测随着SBE7-β-CD浓度的改变透光率曲线。如图2.5所示,连续添加SBE7-β-CD后,混合溶液的光学透光率先降低后升高。其最小值出现在SBE7-β-CD浓度为0.028mmol/L时,透光率的迅速下降表明SBE7-β-CD与BDBAB之间形成了大的聚集体,随后透光率的增加表明了聚集体的分解。这可能是由于随SBE7-β-CD浓度的不断增加,其浓度会逐渐大于BDBAB,当SBE7-β-CD过量存在时BDBAB的疏水尾部容易进入到SBE7-β-CD的空腔中,从而形成包合物[59,60],导致聚集体分解。因为透光率最低时SBE7-β-CD的浓度为0.028 mmol/L,BDBAB浓度为0.2 mmol/L,故BDABB/SBE7-β-CD最佳摩尔混合比为7:1。这些结果表明SBE7-β-CD的多重电荷在BDBAB的分子诱导聚集中起着重要作用。故在本工作中,构筑组装体时使用SBE7-β-CD的浓度为0.0 5mmol/L,BDBAB的浓度为0.35 mmol/L。

  图2.5(a)固定BDBAB浓度为0.20 mmol/L,溶液在不同SBE7-β-CD浓度存在时在25°C下的透光率曲线;(b)透光率在450nm处的值随着SBE7-β-CD浓度的改变而改变。

  通过动态激光衍射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)和zeta电位对该组装体进行分析。如图2.6 a所示,由TEM可以看出的组装体为球形结构,粒径分布在150-550 nm之间,平均粒径约为350nm。这种结构并非是中空的囊泡结构,可能是一种逐层结构的纳米粒子。这种逐层结构形成的机理可能是:在本研究中使用的浓度下,单独BDBAB分子不能形成大的纳米粒子。随SBE7-β-CD的加入,一个SBE7-β-CD分子通过静电作用吸引了七个BDBAB分子,形成一种络合物。这些络合物由于疏水作用结合在一起形成层状的聚集体,这些层状的聚集体曲形成具有交替壳结构的一层又一层的球体[61]。

  图2.6纳米粒子的动态激光衍射(DLS)和TEM

  利用动态激光衍射(DLS)对该纳米粒子的尺寸进行表征,经过三次测试得到该纳米粒子粒径分布在141至600 nm之间,平均粒径为341 nm。这一结果与TEM结果基本一致。结合上述分析,得到了该纳米粒子可能的结构模型如图2.7所示:

  图2.7纳米粒子可能的结构

  zeta电位是纳米粒子的一个重要参数,只有当zeta电位的绝对值在一定数值范围(>20mV),超分子自组装纳米粒子有较为良好的稳定性[62,63]。如图所2.8示,该纳米粒子的zeta电位测定为-23.45mV,表明其有较为良好的稳定性。粒子所带的负电荷可能是由于带负电荷的SBE7-β-CD处于粒子的外表面所致。这种负电荷,将使该粒子对带正电荷的模型药物具有较好的静电吸引作用,故在之后的药物负载实验中我们选择了带正电荷的DOX作为模型药物。

  图2.8 zeta电位

  为测试温度对纳米粒子的影响,将纳米粒子溶液加热至50℃,之后将溶液冷却至室温25℃,测量两个温度下溶液的透光率曲线,通过观察450nm处透光率的变化从而探讨温度对纳米粒子稳定性的影响[64,65]。如图2.9所示,当温度在25和50℃之间变化时,纳米粒子的透光率变化很小,数值变化不到5%,并且重复多次后也无较大变化。表明温度的变化对纳米粒子的稳定性没有显著地影响,温度的改变不会使纳米粒子大量形成或者大量解离。纳米粒子在25-50℃这一温度范围有较为良好的热稳定性。