中国知网查重 高校在线论文查重入口

立即检测
  • 58 元/篇
    系统说明: 知网职称论文检测AMLC/SMLC是杂志社专用系统,针对投稿论文、评审论文、学校、单位职称论文的学术不端重复率检测系统。
  • 298 元/篇
    系统说明: 知网本科论文检测PMLC是最权威的大学生毕业论文检测系统,含“大学生论文联合对比库”,国内95%以上高校使用。检测结果和学校一致!
  • 498 元/篇
    系统说明: 此系统不支持验证!可用作研究生初稿检测,相比知网VIP5.3缺少“学术论文联合对比库”,检测结果有5%左右的误差!(论文中若参考往届研究生论文,重复率误差会较大)
  • 128 元/篇
    系统说明: 大分解论文检测系统,对于想检测学术不端文献检测系统,而又价格便宜的同学可以选择,限每篇2.9万字符,结果与大学生PMLC、硕博VIP定稿系统有出入!
  • 68 元/篇
    系统说明: 知网论文小分解检测系统,适合中国知网初稿查重,数据库和定稿查重不同。结果与本科PMLC,研究生VIP5.3有出入,限每篇1.4万字符!
  • 3 元/千字
    系统说明: 学术家论文重复率检测系统,支持学位论文、毕业论文、投稿论文、职称评审论文,提供全文对照,word标红报告,性价比超高!
论文技巧大全-中粒咖啡磷酸甘油酸变位酶的分离与表达模式分析
时间:2021-05-17 10:28:46

  作为糖代谢过程中的关键酶之一,磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyceratemutase,PGAM)普遍存在于各种植物中,在植物生长发育及非生物胁迫响应过程中扮演者重要的角色。咖啡是世界三大饮品之一,中粒咖啡占据了全球30%的咖啡豆市场。随着市场需求的增大,中粒咖啡的高山栽培和种植趋势日益明显,但低温胁迫成为了中粒咖啡高山栽培的重要限制性因素之一。在中粒咖啡中,对PGAM基因家族的鉴定及表达模式分析还鲜有报道。本研究在中粒咖啡(Coffea canephora)全基因组水平上对PGAM家族进行分离鉴定和系统进化分析,运用实时荧光定量PCR对前期分离到的中粒咖啡冷胁迫应答基因,磷酸甘油酸变位酶编码基因Cc05_g00860的表达模式进行深入研究,并构建超表达载体以期验证该基因的功能。这些研究为我们进一步了解中粒咖啡PGAM家族的功能提供了基础资料,为揭示Cc05_g00860基因在冷胁迫中所发挥的作用提供了依据。具体结果如下:

  1.根据已报道的拟南芥PGAM家族氨基酸序列,通过同源比对在中粒咖啡基因组上共鉴定出19个PGAM家族成员,其中包括18个dPGAM和1个iPGAM。对中粒咖啡和拟南芥中PGAM家族成员的氨基酸序列进行比对并进行系统进化分析,将PGAM家族成员分为三个亚组。

  2.对Cc05_g00860基因进行表达模式分析,发现该基因在不同程度的冷处理条件下均有不同程度的表达,且在4℃冷处理条件下表达量显著提高,约为对照组表达量的4倍。

  3.通过克隆得到中粒咖啡PGAM家族成员中的一个基因Cc05_g00860,成功构建植物超表达载体JJ461-Cc05_g00860,以期对该基因在中粒咖啡响应冷胁迫过程中的所发挥的作用进行进一步的研究。

  植物整个生长发育进程中,不可避免的会遇到各种不利环境带来的胁迫,例如低温。低温带来的冷胁迫会对植物的生长发育产生影响,不仅影响着植物的地理分布,还对作物产量等造成极大威胁(Chinnusamy et al.,2007)。

  研究表明,冷胁迫下植物的细胞膜系统最先受到伤害(Steponkus,1984),这也是冷害的根本原因。细胞膜膜脂相的变化是冷胁迫对膜系统造成的主要损害(Xin et al.,2000),它会使得植物细胞膜正常功能的发挥受到阻碍,选择性丧失以及电解质侧漏。(Steponkus et al.,1993)。

  同时,低温胁迫会对植物的光合作用和呼吸速率造成影响,减少水分和养分等吸收(Zhang et al.,1998),限制植物光合速率,影响植物正常光合产物的合成(Arisz et al.,2005)。低温胁迫还会造成植物体内活性氧失衡(杜秀敏等,2001)。,从而导致植物细胞遭受氧化胁迫,影响植物正常的生理生化代谢(Levine et al.,1994)。

  植物在遭受低温胁迫时,其体内的脯氨酸、可溶性蛋白质以及可溶性糖等渗透调节物质的含量会提高,这是植物应对低温逆境的表现(Nagao et al.,2006)。

  1.1.2糖代谢在冷胁迫中的作用

  在长期进化过程中,为了适应和抵抗冷胁迫,植物形成了响应胁迫的调控机制,以此来适应环境,缓解低温带来的伤害。这些调控机制主要包括两方面,即细胞内含物含量或活性的变化和细胞结构的改变。细胞内抗氧化剂和渗透调节物质含量的变化属于细胞内含物的改变;细胞膜成分和细胞骨架的变化属于细胞结构的改变。这些改变使植物细胞内物质代谢和能量代谢保持平衡,从而具备抵御低温的能力(Xin et al.,2000)。

  植物在应对冷胁迫时所产生的在结构及生理、生化方面的诸多变化中,代谢水平的变化就是一个非常重要的指标。当植物处于低温胁迫时,其体内众多低温应急基因会被低温诱导表达,代谢水平急剧加快,多胺、可溶性糖等渗透调节物质的诸多代谢水平发生改变(Krasensky et al.,2012),从而与环境相适应。研究表明,低温胁迫与生物代谢之间有着密切联系(Sicher et al.,2011),而糖代谢与其直接相关(Nagele et al.,2013)。

  糖作为主要的代谢调控物质,在植物响应冷胁迫的过程中具有三个基本功能:一是起到保护细胞膜和细胞生命物质的作用(Markovskaya et al.,2010)。冷胁迫下,糖类物质通过末端磷脂化作用来调节膜的流动性,进而达到保护细胞膜结构的目的(Furuya et al.,2014)。

  二是糖在代谢过程中可产生一些保护性能源和物质,使植物适应低温逆境。在低温胁迫时,许多植物通过将体内贮存的淀粉转化成糖的方式来增加细胞液浓度,以减轻低温对植物的伤害。研究表明,冷篙在响应冷胁迫时,气温在一定限度范围内的下降会使得其体内的可溶性糖含量升高,同时淀粉含量在降低。这是因为淀粉大量水解为可溶性糖,以增加冷篙的抗冷性(王静等,2002)。

  此外,糖作为植物生理生化代谢的基础物质,其氧化磷酸化所产生的活性氧等物质可以为脯氨酸的合成提供必不可少的氧化还原能力。在脯氨酸作用下,细胞膜透性和MDA含量降低,保护了细胞膜的完整性,提高了细胞内抗氧化酶的活性,植物对低温的适应性增强。

  三是通过糖类物质的积累来降低冰点,增强细胞保水能力。研究发现,冷胁迫下,葡萄的叶片内可溶性糖含量会发生变化。在一定范围内,随着温度的下降,可溶性糖含量增加,且相比于抗寒品种,不抗寒品种中上升幅度相对较小,可溶性糖含量偏低(王淑杰等,1996)。近期报道指出,在低温胁迫期间,咖啡(Partelli et al.,2010)、黑麦(Koster et al.,1992)、小麦(Tognetti et al.,1990)等植物通过调节糖代谢途径,积累可溶性糖来响应低温胁迫,但在不同植物中积累的主要可溶性糖种类不甚相同。低温胁迫增加拟南芥和矮牵牛花中棉子糖的含量(Pennycooke et al.,2012);在水稻和小麦幼苗中积累较多的果糖和蔗糖(Turhan et al.,2010);而云莓中蔗糖含量会在低温时迅速提高(Kaurin et al.,1981)。综上,糖代谢在植物响应低温胁迫中扮演重要角色,而磷酸甘油酸变位酶作为糖代谢过程中的关键酶之一,对PGAM家族进行研究有助于进一步了解植物响应冷胁迫的机制。

  1.2磷酸甘油酸变位酶概述

  糖代谢是整个生物代谢的中心,与植物的生长发育、非生物胁迫等过程紧密相关。磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyceratemutase,PGAM)是糖代谢过程中的重要调控酶之一,具有催化3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate,3-PGA)和2-磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate,2-PGA)相互转化的功能。(Fothergill et al.1982)。根据其在催化反应中与辅因子2,3-二磷酸甘油酸(2,3-bisphosphoglycerate,2,3-BPG)的依赖关系,将其分为辅因子依赖型PGAM(Cofactor-dependent PGAM,dPGAM)和辅因子非依赖型PGAM(Cofactor-independent PGAM,iPGAM)(Fothergill et al.1982)。

  PGAM最早在酵母中被发现,随着研究的深入,人们揭示了PGAM的氨基酸序列和晶体结构,也在越来越多的生物体内发现该蛋白。早期,PGAM的研究对象主要集中在动物、真菌和细菌上,尤其是对人类及哺乳动物PGAM的蛋白结构、生理生化特性和功能特点等的研究(Wang et al.,2004)。植物中的iPGAM得到关注是从第一次在玉米中分离纯化到PGAM-i后开始的(Gra?a et al.,1989),但由于植物来源的iPGAM分离纯化困难,对其研究报道相对较少。

  1.3植物iPGAM在非生物胁迫下的作用

  iPGAM不仅参与植物营养生长、气孔运动、花粉形成等多种生长发育过程,在冷胁迫过程中也发挥着重要的作用。研究发现,在拟南芥受低温胁迫时,AtiPGAM1的表达量明显增加,预示着AtiPGAM1参与了拟南芥响应冷胁迫的过程,并在该过程中发挥着正调节因子的作用(Tanaka et al.,2000)。但也有研究表明,部分植物的iPGAM在响应冷胁迫过程中起负调节作用,如水稻花药三核期响应冷胁迫时,iPGAM呈现部分降解,暗示水稻的iPGAM是水稻响应冷胁迫的负调节因子(Imin et al.,2004)。以上研究表明,iPGAM的生物学功能具有多样性,但在中粒咖啡应对冷胁迫时,其磷酸甘油酸变位酶的变化情况尚不明确。

  1.4中粒咖啡概述

  中粒咖啡(Coffea canephora)属于茜草科植物,是亚热带和热带国家和地区的主要经济作物之一,其咖啡豆产量约为世界咖啡豆产量的30%(董云萍,2007)。从咖啡杯品来看,中粒咖啡较小粒咖啡(Coffea arabica)具有更深厚的色泽、更浓郁的风味。从农艺性状来看,中粒咖啡具有更耐高温、耐旱和耐咖啡锈病的特性。因而,中粒咖啡不仅在现有咖啡产业中扮演重要角色,还是及其宝贵的种质资源。近年来,随着咖啡市场对多风味、多层次咖啡的需求,精品咖啡市场的不断扩大,越来越多的中粒咖啡被种植于巴西和中国云南的高海拔地区。然而,高海拔地区的低温时常影响中粒咖啡的生长发育,制约了相关产业的发展。因此,了解中粒咖啡的冷胁迫应答机制,进而开发具有耐冷性的中粒咖啡品种,可以为中粒咖啡的进一步运用和产业发展提供帮助(Dong et al.,2019)。

  1.5研究背景

  前期,实验室对冷胁迫下中粒咖啡中WRKY转录因子家族成员及其下游候选调控成员的响应情况研究发现,中粒咖啡在受到冷胁迫时,WRKY转录因子通过调控其糖代谢过程对冷胁迫做出反应(Dong et al.,2019)。进行基因表达模式分析后发现Cc05_g00860基因的表达量在4℃下呈现显著上调(图1),该结果暗示该基因极有可能在中粒咖啡冷胁迫应急响应中下扮演了重要角色,但其具体的生物学功能尚不明确。进一步的生物信息学分析发现Cc05_g00860属于中粒咖啡磷酸甘油酸变位酶中的辅因子非依赖型PGAM(iPGAM)。因此,分离中粒咖啡中磷酸甘油酸变位酶的编码基因成员及其研究他们中粒咖啡冷胁迫应答中的响应,能助力于后续中粒咖啡冷胁迫应急响应机制的揭示和研究。

  1.6立题的意义、目的及主要研究内容

  PGAM作为糖代谢过程中的关键之一,在植物相应冷胁迫过程中起着重要作用。本研究基于中粒咖啡基因组数据,对PGAM家族进行分离鉴定和系统进化分析,同时对中粒咖啡冷胁迫下磷酸甘油酸变位酶编码基因Cc05_g00860的表达模式进行了分析,并构建了超表达载体,完成了拟南芥的异源转化。研究结果能不仅丰富了人们对低温胁迫下植物体内磷酸甘油酸变位酶响应机制的认知,还为进一步揭示Cc05_g00860基因在冷胁迫中的功能提供依据,同时为研究Cc05_g00860的具体生物学功能奠定了基础。

  第二章中粒咖啡PGAM家族成员的鉴定

  2.1材料与方法

  2.1.1中粒咖啡PGAM家族成员鉴别

  从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中下载已报道的拟南芥PGAM的所有蛋白序列作为查询序列,根据获得的序列信息,在中粒咖啡基因组网站(Coffee Genome Hub,http://coffee-genome.org/)中以e-5为阈值进行多重序列联配搜索(BLASTp),筛选出中粒咖啡基因组中的CcPGAM候选基因序列。蛋白质分子量、等电点和氨基酸大小等从ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)数据中下载得到。

  2.1.2中粒咖啡PGAM家族的进化分析

  使用PGAM在拟南芥和中粒咖啡的全长蛋白序列,以MEGA 7构建系统进化树,分析中粒咖啡PGAM家族基因与拟南芥PGAM家族基因系统进化关系。根据Neighbor-Joining法建树,采用自举法(bootstrap)对系统进化树进行检验,共循环1000次。

  2.2结果与分析

  2.2.1中粒咖啡PGAM家族成员的鉴定

  根据已报道的拟南芥PGAM家族蛋白序列,通过BLASTp在C canephora基因组网站中得到19个E值小于e-5的候选PGAM成员,其中包括18个dPGAM,1个iPGAM。根据PGAM基因家族成员在染色体上的位置将在中粒咖啡中确认的18个dPGAM基因命名为CcdPGAM1-CcdPGAM18,将唯一一个iPGAM基因命名为CciPGAM1。基于预测的蛋白质序列利用ProtParam数据分析得到19个中粒咖啡PGAM氨基酸数、分子量和等电点。由表1可以看出,PGAM的氨基酸长度在112 aa-753 aa之间;从蛋白分子量看,最大的为83.621 kDa,最小的为12.633 kDa;从等电点来看,中粒咖啡PGAM蛋白的理论等电点在4.43-9.12之间;就PGAM基因在染色体上的分布来看,分布不均。其中2号染色体含有最多的PGAM基因,有4个成员(21.0%),0号、4号、5号染色体各含有1个家族成员。

  表1中粒咖啡PGAM基因家族的基本特征分析

  基因编号基因名氨基酸长度(aa)分子量(Da)等电点染色体

  Cc05_g00860 CciPGAM1 559 61119.32 5.42 05

  Cc01_g09760 CcdPGAM1 404 44622.58 5.50 01

  Cc01_g14510 CcdPGAM2 753 83621.02 6.64 01

  Cc02_g13340 CcdPGAM3 297 33379.00 8.67 02

  Cc02_g20540 CcdPGAM4 374 40795.59 8.26 02

  Cc02_g24830 CcdPGAM5 255 28061.44 5.18 02

  Cc02_g32580 CcdPGAM6 310 36227.38 6.14 02

  Cc04_g13740 CcdPGAM7 315 34394.03 5.63 04

  Cc07_g01210 CcdPGAM8 438 48487.22 5.32 07

  Cc07_g05810 CcdPGAM9 300 32972.00 7.21 07

  Cc07_g15470 CcdPGAM10 349 39744.40 6.84 07

  Cc08_g07930 CcdPGAM11 329 36826.72 9.12 08

  Cc08_g15060 CcdPGAM12 340 39361.53 8.80 08

  Cc09_g00050 CcdPGAM13 239 26501.11 8.88 09

  Cc09_g10670 CcdPGAM14 125 13619.56 9.03 09

  Cc09_g10680 CcdPGAM15 112 12663.44 4.43 09

  Cc10_g07520 CcdPGAM16 345 38912.62 8.99 10

  Cc10_g08210 CcdPGAM17 289 31809.03 5.99 10

  Cc00_g33760 CcdPGAM18 125 13590.46 8.64 00

  2.2.2PGAM家族的进化分析

  为了研究中粒咖啡PGAM基因家族成员的系统进化关系,利用中粒咖啡与拟南芥PGAM家族成员的氨基酸序列构建进化树加以分析(图2)。据进化树可知,PGAM家族基因被分为三个不同的亚组,第一个亚组有5个成员,如图2黄色支线所示;第二个亚组有2个成员,如图2蓝色支线所示;第三个亚组有14个成员,如图2绿色支线所示。

  图2中粒咖啡和拟南芥PGAM基因家族成员的进化树分析

  注:成员拟南芥由绿色三角表示;中粒咖啡iPGAM由蓝色方块表示;中粒咖啡dPGAM由蓝色方块表示。

  3.1讨论

  PGAM影响着生物的糖代谢过程,且在生物体内广泛参与生理生化代谢途径。在高等植物的研究报道中,拟南芥的PGAM研究较多。截至目前,共发现拟南芥PGAM家族成员有21个,仅有两个被表明具PGAM活性,即iPGAM1(At1g09780)和iPGAM2(At3g08590),其他家族成员情况仍未得到证实。经NCBI查询发现,玉米、水稻中标注为PGAM的蛋白分别有9个和3个,这些蛋白的特性及功能尚不明确(谢鑫等,2015)。随着中粒咖啡基因组测序的完成,对中粒咖啡PGAM家族成员进行分离和鉴定变的可行,且研究结果有利于丰富人们对PGAM的认识,为后续PGAM的研究提供参考资料。

  本研究利用已公布的拟南芥PGAM家族作为查询序列,分离出中粒咖啡PGAM家族成员19个,根据PGAM家族成员系统进化关系将其分为三个不同的分枝(图2)。通过系统进化树,我们可以看出,中粒咖啡PGAM家族成员间的同源性并不高,这可能与植物PGAM家族在生物进化过程中衍化出许多成员有关。有研究将最早报道的嗜热脂肪芽孢杆菌PGAM和已知的拟南芥、玉米、水稻的PGAM成员进行序列比对,构建系统进化树,发现同种来源的PGAM并非一定包含在相同亚群中。比如细菌的蛋白序列与拟南芥中At3g30841和At4g09520的蛋白序列同源性相对较高,与At3g08590和At1g09780的蛋白序列同源性较低,它们处于不同的亚群中(谢鑫等,2015)。

  第三章冷胁迫下CciPGAM1表达模式的验证

  结合PGAM基因家族的生物信息学结果和实验室前期对冷胁迫下中粒咖啡中WRKY转录因子家族成员及其下游候选调控成员响应情况的研究结果,选择Cc05_g00860基因作为主要研究对象,对其在不同温度处理下的表达模式进行分析,以期对其与中粒咖啡冷胁迫响应的关系进行进一步的探索。

  3.1试验材料

  一年生咖啡种苗由云南省瑞丽市农业部咖啡种质资源库提供。植物材料运至昆明后,置于长日照(16 h light/8 h dark),24℃的温室中进行培养。冷处理实验操作如下:将植株移入培养箱24℃/20℃(昼/夜)培养7 d,然后放入13℃/8℃(昼/夜)培养7 d进行积冷处理,最后在4℃/4℃(昼/夜)培养条件下进行3 d的冷处理。冷处理期间,固定以下参数:光周期(16 h light/8 h dark),湿度(60%)和光度(600-650μmol m-2 s-1)。在每个处理时间点结束时,进行不放回取样,具体操作为取5株植株,每株植株取顶部两对新叶。试验设置三个生物学重复。

  3.2试验方法

  3.2.1Cc05_g00860表达模式分析

  3.2.1.1总RNA的提取

  以24℃/20℃(昼/夜)、13℃/8℃(昼/夜)、4℃/4℃(昼/夜)三个冷处理下的中粒咖啡为样品,其中24℃/20℃(昼/夜)条件下处理的植物材料为对照,使用宝生物试剂盒的RNAiso Plus提取样品总RNA,试验设置3个生物学重复。

  RNA提取后,以DEPC为空白对照,对其进行纯度检测,主要测定RNA浓度及OD260/280值。取OD260/280值介于1.8-2.0之间的RNA进行反转录合成cDNA。

  3.2.1.2反转录

  cDNA合成试剂盒采用宝生物试剂盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNAEraser,分别以1.0 ng不同冷处理条件下的RNA为模板,RT Primer Mix为引物,先用gDNA Eraser去除样品中所含基因组DNA,然后经Prime Script RT Enzyme MixⅠ反转录合成cDNA,具体操作如下:

  1.按以下体系配制,42℃,2 min、4℃PCR反应。

  表2去除基因组DNA体系

  反应物反应体系

  5×gDNA Eraser Buffer 2μL

  gDNA Eraser 1μL

  Total RNA 1μg

  RNase Free dH2O补足至10μL

  2.将上述溶液配制以下体系,混匀,37℃15 min、85℃5 s、4℃PCR反应。

  表3反转录体系

  反应物反应体系(μL)

  步骤1反应液10

  Prime Script RT Enzyme MixⅠ1

  RT Primer Mix 1

  5×Primer Script Buffer2 4

  RNase Free dH2O 4

  注:以上操作均在冰上进行。

  3.2.1.3实时荧光定量PCR

  根据2.1.1中分析得到的候选基因CDS(coding sequence)序列,使用Primer-Blast设计qRT-PCR特异性引物(表4),以多聚泛素蛋白基因UBQ为内参基因,进行qRT-PCR分析,检测植物体内基因表达的丰度。qRT-PCR使用QuantStudio?7 Flex Real Time PCR系统(Applied Biosystems?,Foster City,CA,USA)进行,使用的试剂盒为宝生物试剂盒的TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ。

  表4 qRT-PCR引物

  引物名序列(5’-3’)引物大小(bp)

  5g00860

  F:GATCACCCGAAGCTTCCCAA

  R:CCGTGAGCCTTCACCAATCT 167

  UBQ F:TGCTGTACTCTGTTGAAGCTGTCTT

  R:CCCATGCACGATAACACCAA 65

  1.将反转录产物cDNA原液稀释至浓度为12.5 ng/μL后,按表5配制20μL反应体系。

  表5 qRT-PCR反应体系

  反应物反应体系(μL)

  TB Green Premix Ex TaqⅡ10

  5g00860-F 0.8

  5g00860-R 0.8

  cDNA 2

  ROX Reference DyeⅡ0.4

  ddH2O 6

  Total 20

  注:TB Green应避光保存,且加入TB Green时也应遮光操作;

  2.qRT-PCR反应程序如下:

  95℃预变性10 s

  95℃变性15 s

  55℃退火1 min

  40个循环后,先95℃融解15 s,再60℃融解1 min,绘制融解曲线

  3.qRT-PCR数据分析:采用2???Ct法分析目标基因表达差异,其结果由qRT-PCR仪Analyze导出。所有qRT-PCR均使用来自三个生物重复的样品,每个样品进行3次技术重复。

  3.3结果与分析

  3.3.1Cc05_g00860的表达模式分析

  为了验证Cc05_g00860与在冷胁迫下的应急响应,采用qRT-PCR技术分析Cc05_g00860基因在不同温度处理下的表达水平。将对照组基因相对表达量均一化为1,结果表明(图3),Cc05_g00860基因在冷胁迫处理后均有表达,但因处理温度不同呈现出不同的表达模式。13℃处理条件下,Cc05_g00860基因的表达量与对照组无显著差异;4℃处理后,Cc05_g00860的表达量显著提高,约为对照处理的4倍。这一结果与前期实验室对冷胁迫下中粒咖啡WRKY转录因子家族成员下游候选调控成员聚类分析结果基本一致,说明Cc05_g00860很可能与中粒咖啡抵御冷胁迫有关。

  图3 Cc05_g00860的基因表达水平分析

  3.4讨论

  本部分为了研究中粒咖啡Cc05_g00860基因在中粒咖啡不同程度低温胁迫下的潜在生物学功能,对该基因的表达模式进行分析,结果发现中粒咖啡Cc05_g00860基因在不同温度的冷胁迫处理下均有不同程度的表达,且随着冷处理温度的降低,Cc05_g00860基因的相对表达量整体表现为较为稳定的上调趋势,可能说明该基因的表达受外界温度变化的影响较为明显。

  进一步分析发现,Cc05_g00860基因在4℃冷处理条件下表达量显著提高,约为对照组表达量的4倍。由此推测,该基因可能参与了中粒咖啡冷胁迫响应过程,且在该过程中发挥着正调节因子的作用。之前也有研究发现拟南芥在受低温胁迫时,AtPGAM1表达量明显提高,在拟南芥响应冷胁迫过程中起正调节因子的作用(Tanaka et al.,2000)。

  植物在遭受低温伤害时,通常会表现出一些低温适应性反应,如可溶性糖含量升高,从而使植物的耐冷性提高。冬小麦在低温环境下大量合成蔗糖和果糖,草在低温下积累了果糖,水稻的抗寒性与蔗糖、果糖和阿拉伯糖含量密切相关(陈超,2014)。PGAM是糖代谢过程中重要的的调控酶之一,Cc05_g00860作为中粒咖啡磷酸甘油酸变位酶家族成员中的一员,由于其在4℃低温处理下表达量的显著提高,推测该基因可能通过调控中粒咖啡冷胁迫下的糖代谢过程来对低温做出反应。

  第四章基因的克隆及功能分析

  4.1试验材料、菌株和载体

  4.1.1植物材料

  本研究所用的材料为一年生咖啡种苗(由云南省瑞丽市农业部咖啡种质资源库提供),温室培养,温室设置为:24℃,16 h light/8 h dark,湿度60%。

  转基因拟南芥所用的材料为哥伦比亚生态型(Columbia-0)拟南芥,生长在光照培养箱,培养箱设置:光周期(16 h light/8 h dark),湿度(60%)和光度(600-650μmol m-2 s-1)。拟南芥播种前需置于4℃遮光条件下培养2-3 d,以完成种子的春化过程,保证出苗整齐一致。以珍珠岩和营养土为基质,1:1混合,将春化后的种子点播至塑料小盆中(每盆5颗种子),表面覆盖保鲜膜,置于光照培养箱中培养,并定期对拟南芥苗进行管理。

  4.1.2载体与菌株

  大肠杆菌转化感受态DH5α和pLB Vector购自TIANGEN公司;农杆菌转化感受态GV3101购自北京华越洋生物科技有限公司;拟南芥表达载体pCambia系列衍生的JJ461由本实验室保存。

  4.2生物信息学软件和网络资源

  本研究所用的软件、网站及相应用途如表6所示。

  表6本研究所用的软件和网站

  软件名称用途

  Microsoft Excel 2010 qRT-PCR分析、统计学分析等

  Primer Premier 5.0引物设计、酶切位点检测

  Photoshop作图

  NEBcutter2引物设计、酶切位点检测

  MEGA 7.0系统进化树的构建、序列比对

  Clustal X蛋白序列的比对

  NCBI基因、蛋白相关信息的检索、分析、序列比对

  Coffee Genome Hub中粒咖啡基因、蛋白信息的检索、分析

  TAIR拟南芥蛋白信息的检索、分析

  Proparam氨基酸序列长度、蛋白大小、等电点的计算

  4.3酶及各种生化试剂

  本研究所用的酶、生化试剂及购买公司如表7所示。

  表7本研究所用的试剂

  试剂购买公司

  EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit TransGen Biotech

  EasyPure?Quick Gel Extraction Kit TransGen Biotech

  Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser TAKARA

  TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡTAKARA

  RNAiso Plus TAKARA

  1 kb plus DNA Ladder TIANGEN

  Ex Taq DNA酶TAKARA

  T4-DNA连接酶TAKARA

  4.4试验仪器

  本研究常用的仪器设备及其用途如表8所示。

  表8常用的试验仪器

  仪器用途

  恒温培养箱培养菌

  恒温干燥箱干燥

  光照培养箱拟南芥种植

  振荡器振荡

  凝胶电泳及成像仪器跑胶

  电子分析天平称量

  台式高速离心机离心

  超低温冰箱储藏

  制冰机制冰

  PCR仪控温、基因扩增

  电泳仪电泳

  无菌超净工作台无菌操作

  金属浴控温、热激

  高压蒸汽灭菌锅灭菌

  台式摇床培养、活化菌液

  QuantStudio 7 Flex荧光实时定量

  超微量紫外分光光度计DNA、RNA浓度及OD值测定

  微波炉加热

  超纯水仪ddH2O

  4.5常用试剂及培养基的配制

  4.5.1常用溶液的配制

  本研究常用的溶液如表9所示。

  表9常用溶液的配制方法

  名称药品体积(L)用途

  TAE 0.04 mol/L Tris-AC和1mmol/L EDTA 1电泳液

  1 mol/L氢氧化钾56 g KOH 1调节pH

  1 mol/L氢氧化钠40 g NaOH 1调节pH

  4.5.2常用抗生素

  本研究常用的抗生素及其工作浓度如表10所示。

  表10抗生素的工作浓度

  抗生素储存温度(℃)工作浓度(μg/mL)

  氨苄青霉素-20 100

  利福平-20 10

  卡那霉素-20 25

  4.5.3常用培养基的配制

  本研究常用培养基及其配制方法如表11所示。

  表11培养基的配制方法

  培养基用量体积(L)用途

  LB固体培养基5 g酵母提取物,氯化钠、胰蛋白胨各10 g,15 g琼脂1菌液的活化、扩繁

  LB液体培养基5 g酵母提取物,氯化钠、胰蛋白胨各10 g 1菌落培养

  YEP液体培养基10 g酵母提取物,10 g胰蛋白胨,5 g氯化钠1菌液的活化、扩繁

  YEP固体培养基10 g酵母提取物,10 g胰蛋白胨,5 g氯化钠,15 g琼脂1菌落培养

  4.6试验方法

  4.6.1Cc05_g00860基因的克隆

  4.6.1.1Cc05_g00860基因的扩增

  1.引物设计:使用的表达载体为pCambia系列衍生的JJ461(图谱见附表),从Coffee Genome Hub中提取Cc05_g00860基因的CDS(coding sequence)信息(见附表),运用NEB的NEBcutter2(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/index.php)在线软件,分析目的基因标序列的酶切位点情况,选择XbaI和SalI两个酶切位点,设计引物(表12)。以4℃处理的中粒咖啡逆转录产物混合稀释液为模板,用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR扩增(表13)。

  表12扩增引物

  引物名称引物序列引物大小(bp)酶切位点

  00860 F:ATCTAGAATGGGTAGCTCAGGATTTTCATGG

  R:CCGTCGACCTAATTGTCAACTACCTCAAT 1,709 XbaI

  SalI

  注:方框内为限制性内切酶XbaI和SalI的酶切位点序列。

  2.PCR扩增体系:

  表13基因Cc05_g00860克隆体系

  反应成分反应体系(μL)

  dNTP 1.5

  Ex Taq 0.3

  10×Buffer 3

  cDNA 2

  00860-F 1.5

  00860-R 1.5

  ddH2O 20.2

  Total 30

  3.PCR扩增程序为:

  94℃预变性5 min

  94℃变性30 s

  55℃退火30 s

  72℃延伸

  30个循环后,72℃最终延伸7 min 1 min

  4.PCR产物检测:用GeneGreen作核酸染料(TAKARA,每100μL TAE加入0.5μL),进行电泳检测,120 V恒压电泳约20 min。上样前,在样品中加入指示剂10×Loading Buffer(TAKARA)3μL,每个上样10μL。使用1 kb plus DNA Ladder指示片段大小。

  4.6.1.2PCR产物胶回收

  PCR产物进行琼脂凝胶电泳分离后,将大小一致的条带切下,用全式金试剂盒的EasyPure?Quick Gel Extraction Kit进行胶回收。产物回收后,使用紫外分光光度计测定回收DNA浓度,-20℃保存备用。

  4.6.1.3Cc05_g00860与pLB Vector连接

  将回收的目的片段用T4-DNA连接酶连接到pLB Vector上,连接体系如表14所示,冰上配制混合液,轻弹离心管混匀反应液,短暂离心3-5 s后于4℃连接过夜(12-14 h)。

  表14 Cc05_g00860基因与pLB Vector连接体系

  反应成分反应体系(μL)

  pLB Vector 6

  目的片段DNA 1.4

  10×T4 DNA Ligase Buffer 1

  T4 DNA Ligase 1

  ddH2O 0.6

  Total 10

  4.6.1.4大肠杆菌的转化

  热激法将T载体(含Cc05_g00860基因)转化至大肠杆菌DH5α中,利用卡那霉素对阳性单克隆进行筛选。

  4.6.1.5大肠杆菌阳性克隆检测

  1.挑斑检测:挑取阳性单克隆,并对菌液进行扩繁。

  2.PCR检测:将得到的菌液作为模板,进行PCR检测,具体操作如下:

  (1)吸取培养好的菌液500μL至1.5 mL离心管中;

  (2)45,000 rpm,常温(20℃左右),离心5 min;

  (3)弃上清,加入200μL ddH2O,振荡菌块;

  (4)每个克隆菌液吸取1μL用于目的片段PCR阳性检测,PCR反应体系表15所示。

  表15 Cc05_g00860的检测体系

  反应成分反应体系(μL)

  菌液1

  00860-F 1

  00860-R 1

  Mix 22

  Total 25

  (5)在200μL PCR管中加入所有试剂,混匀,瞬时离心后放在PCR仪,反应程序如下:

  98℃预变性2 min

  98℃变性10 s

  55℃退火15 s

  72℃延伸

  25个循环后,72℃最终延伸5 min 15 s

  3.PCR产物酶切:PCR反应结束后,对PCR产物进行酶切,酶切体系如表16所示,37℃金属浴,酶切3 h;

  4.琼脂糖凝胶电泳检测:对酶切产物进行电泳检测,将电泳检测条带大小正确的菌液送样测序(昆明硕擎生物有限公司)。

  表16带目的片段的pLB Vector双酶切体系

  反应成分反应体系(μL)

  10×Buffer 2

  XbalⅠ1

  SalⅠ1

  pLB Vector(带目的片段)10

  ddH2O 6

  Total 20

  4.6.1.6质粒抽提

  对测序正确的菌液使用全式金试剂盒的EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit提质粒,抽提得到的DNA置于-20℃保存备用。

  4.6.2表达载体构建

  4.6.2.1载体的酶切

  使用限制性核酸内切酶XbaI和SalI,对目的片段和pCambia系列衍生的JJ461载体分别进行双酶切,双酶切体系如4.6.1.5所述。酶切完成后按4.6.1.2的方法纯化酶切产物。

  4.6.2.2目的基因与载体的连接

  将目的基因Cc05_g00860与纯化的JJ461空载片段用T4-DNA连接酶连接起来,连接体系如4.6.1.3所述。

  4.6.2.3重组物转化大肠杆菌

  将目的基因Cc05_g00860与JJ461重组物按4.6.1.4转化大肠杆菌。

  4.6.2.4重组物质粒抽提

  按4.6.1.5所述方法进行菌落PCR检测,检测正确的条带送公司测序,测序正确后按4.6.1.6所述方法提取重组产物质粒。

  4.6.3拟南芥中超表达Cc05_g00860基因

  4.6.3.1农杆菌转化

  (1)取一管GV3101感受态置于冰盒融化,无菌条件下加入5μL目的片段和JJ461载体的重组产物质粒,轻敲混匀;

  (2)放入液氮中冷冻1 min;

  (3)37℃金属浴5 min;

  (4)于超净工作台加入1 mL无菌YEP液体培养基,30℃孵育2-4 h;

  (5)4000 rpm,离心5 min,弃上清液900μL;

  (6)剩100μL左右的菌液涂布双抗(卡那霉素和利福平)抗性的YEP平板,28℃孵育48 h;

  (7)倒5 mL YEP液体培养基至15 mL离心管,按比例加入抗生素(卡那霉素:25μg/mL;利福平:10μg/mL)

  (8)挑农杆菌单克隆至离心管中,30℃,约200 rpm摇床培养12-24 h;

  (9)将获得的菌液进行PCR验证,方法参照4.6.1.5。

  4.6.3.2农杆菌的扩繁

  (1)将4.6.3.1中得到的5 mL菌液均分至两瓶50 mL的YEP溶液中,30℃振荡培养24 h;

  (2)再将50 mL菌液均分至两瓶250 mL的YEP溶液中,30℃振荡培养24-48 h,直至OD600值大于1.6;

  (3)菌液4℃,4500 rpm条件下离心10 min,弃上清;

  (4)重复步骤(3);

  (5)配制150-200 mL的重悬液重悬菌体(1L重悬液分别需要2.2 g MS、50 g蔗糖,0.5 g MES,KOH调pH至5.7左右,用重悬液重悬菌体。

  4.6.3.3拟南芥的遗传转化

  (1)在盛花期对拟南芥进行侵染。将事先已剪去荚果的拟南芥花序浸泡在上述混匀液中2 min,植株外套一塑料袋(注:重悬液使用后应置于4℃保存);

  (2)将植株放倒(平放),室温下放置一夜;

  (3)移液枪吸取重悬液,再次对拟南芥花序进行侵染。