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论文写作模式-地塞米松对LPS诱导急性肺炎模型
时间:2021-05-18 09:29:10

  感染性疾病以及所引发的炎症一直是畜禽健康的重要隐患,持续的感染和炎症反应轻则引起组织损伤,重则引起器官功能障碍、肿瘤以及死亡。地塞米松,是常用的一种人工合成的含氟长效糖皮质激素(又称甾体类激素),在临床上主要用于抗炎和治疗严重细菌感染。本实验以脂多糖(LPS)作为致病因素,以地塞米松为研究药物,通过鼻腔吸入法建立小鼠肺炎模型,将模型小鼠分为两组:治疗组和评价组。评价组为18只小鼠,将其分为6组,分别在建模后0h、3h、6h、12h、24h、48h进行解剖,制作肺组织病理切片,HE染色后观察肺泡细胞病变及炎性细胞变化,按照其损伤程度大小,建立肺损伤病理评分标准,对后续的治疗组进行对比评价;治疗组为24只小鼠,将其分为6组,分别在建模后0h、3h、6h、12h、24h、48h进行地塞米松注射液(10mg/kg体重)给药治疗,给药治疗24h后进行解剖,制作肺组织病理石蜡切片,HE染色后观察肺泡细胞病变程度及炎性细胞变化,通过对比评价组建立的的评价标准,观察地塞米松(10mg/kg体重)对LPS诱导肺炎不同发展阶段的治疗效果。以期获得该药物介入治疗的最佳时机。

  结果表明:LPS感染后0h,小鼠肺部正常,仅气管上皮细胞有轻微炎性细胞浸润。3h、6h、12h、24h均有肺泡壁增厚、炎性细胞浸润等肺部病变,且随着感染时间的增加,病变愈发广泛、严重。感染后48h,炎性细胞严重浸润,肺泡壁明显增厚,肺组织广泛实化,肺器官功能基本丧失;LPS诱导肺炎模型小鼠分别在建模后0h、3h、6h、12h、24h、48h进行地塞米松注射液(10mg/kg体重)给药治疗。通过与评价组进行比较发现:3-6小时内,为最佳用药时机。该时间段内地塞米松介入治疗,对于LPS诱导的急性肺炎小鼠模型有明显的治疗效果,且愈后最佳。

  细菌是常见的病原微生物之一,革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(G+细菌)和革兰氏阴性菌(G-细菌),二者在结构、致病机理方面均有不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中包含着一种特殊的致病结构,这是G-细菌与G+细菌在致病方面的主要差别,该结构为脂多糖(LPS)。如何消除或减轻LPS对宿主的损伤,是治疗革兰氏阴性菌的主要着手点。

  地塞米松是临床上常见的抗炎、抗毒素药物,主要用于治疗严重细菌感染和严重过敏性疾病、粒细胞减少症等。对于革兰氏阴性菌,糖皮质激素药物的抗毒素作用显得尤为重要。传统治疗细菌感染时,通常使用多种抗生素进行治疗[1],随着医学以及生命科学研究的发展发现,配合使用糖皮质激素类药物能更好、更快、更安全的治疗感染性疾病,并减少机体产生抗药性的几率[2]。鉴于机体对糖皮质激素类药物在使用上的敏感性及不良反应,其在治疗过程中的介入时机非常关键,即病程发展至何种阶段时使用糖皮质激素不会引起机体产生不良反应,该问题已成为目前在该类药物研究领域中的的焦点。

  1.1革兰氏阴性菌的结构及致病作用

  微生物感染引发的疾病在临床治疗中非常常见。细菌是微生物大类中,最常见的一类。革兰氏阴性菌(G-细菌)的毒力因子是细胞壁的组成结构之一。

  1.1.1革兰氏阴性菌的结构

  G-细菌的细胞壁结构复杂。由1~2层的肽聚糖、外膜和周质间隙构成。外膜由脂多糖、磷脂、蛋白质和脂蛋白等复合构成[3]。

  脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是外膜的最表面结构,为G-细菌独有的结构。由三部分组成,分别是:侧链多糖、核心多糖和类脂A。类脂A(ipid A)是一种葡萄糖链和脂肪酸链的结合物,是内毒素的主要毒性成分,发挥多种生物学效应,包括导致动物体发热,炎性细胞浸润、增多,严重者可休克死亡。在不同种属的细菌中,编码类脂A的遗传信息非常相似,无种属特异性[4]。在脂多糖的组成结构中,具有特异性的是侧链多糖(O-polysaccharide),也被命名为特异多糖,是LPS最外层的结构,也是G-细菌的抗原[5]

  外膜蛋白(ouiter membrance protein,OMP)是G-细菌最外层的结构。其中,起分子筛的作用的是微孔蛋白,仅允许小分子质量的营养物质通过(例如离子),大分子物质不能通过(例如蛋白质)。酶的本质是蛋白质或核酸,无法通过微孔蛋白,因此溶菌酶等抗菌物质不易作用到G-细菌的肽聚糖[6]。

  1.1.2革兰氏阴性菌的致病作用

  G-细菌的毒力因子被命名为内毒素(endotoxin)。当抗菌药物作用于细菌的细胞壁,会使其结构发生变化,渗透性增加,导致细菌肿胀裂解。裂解后,内毒素从中释放出来,开始对宿主发生致病作用[7]。内毒素的本质是脂多糖(LPS),由O特异多糖侧链、非特异核心多糖和类脂A三个部分组成[8]。具有毒性的部分是类脂A,使LPS与革兰阴性菌外膜的联结结构。DNA序列中类脂A的编码部分高度保守[9],使得各种属细菌的类脂A在结构、毒力、毒性等方面都大致相同,因此生物学功能也大致相同,都能导致发热、血液中白细胞骤减、DIC、休克等,严重时亦可致死[10]。内毒素耐高温,必须加热至180°C经3~4h才失活。因此感染初期导致的机体发热对体内的内毒素活性并无影响,从而血液中白细胞持续聚集,炎症反应愈发严重[11]。

  1.2 LPS的致病机理

  内毒素性休克是动物感染G-细菌后的主要症状,最终会导致DIC、全身多器官衰竭、甚至死亡。LPS是内毒素的核心致病成分,其致病机理主要是介导失控性炎症反应失衡和导致微循环障碍两个方面[12]。此外,当内毒素被体内炎症细胞表面的受体识别后,炎症信号通路被大规模开放,导致炎症反应失控。炎症的失控也是多器官损伤的重要原因,各种脏器(心、肝、肺、肾)损伤尤为严重[13]。

  1.2.1 LPS介导失控性炎症

  炎症反应是机体抵御外界刺进因子入侵的防御机制,当外界刺激因素与炎症细胞表面受体结合后,激活下游的信号传导通路,促进NF-kB和AP-1等转录因子结合至核基因组上,染色质发生重塑,从而促进了炎性基因的转录和翻译,导致炎性细胞的增殖、活化、迁移及浸润至组织局部,导致炎症的发生及发展[14]。

  LPS入侵机体后,可激活多条信号分子通路介导炎症因子的释放,相关炎症因子包括Toll样受体4(toll-like receptor,TLR4)、高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1 protein,HMGBl)、晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation end products,RAGE)等[15]。目前所知最主要的炎症反应机理为TLR4介导的信号分子通路,在TLR4介导的信号通路中,Toll样受体4(TLR4)可以特异地识别到LPS,LPS结合TLR4后,增加炎症因子转录,加强细胞因子的表达,从而做出快速的免疫应答[16]。

  1.2.2 LPS导致微循环障碍

  LPS进入体内后,被炎症细胞识别的同时,会主动攻击动物血管内皮细胞,血管上皮细胞受损后可进入血液,白细胞、血小板等组织破裂坏死[17],引起全身血液粘稠度增高,血液流速降低,流经器官组织时氧气交换量减少,导致血液无法正常进行氧气交换,导致机体缺氧,引发弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)[18]。使组织细胞出现物质代谢障碍,引起组织细胞坏死与凋亡,最终导致多器官功能障碍直至衰竭死亡[19]。另外,当血液流速下降后,机体更快进入淤血缺氧期,出现心力衰竭,更大程度地加剧了微循环障碍[20]。

  LPS感染后期,持续缺血缺氧使机体无氧酵解增强,堆积过多的乳酸无法进行转化,从而引发机体酸中毒,加重细胞代谢障碍,导致动物死亡[21]。

  1.3地塞米松对LPS的治疗作用

  糖皮质激素属于糖皮质激素类药物,也称甾体类药物,在治疗炎症性和感染性疾病时使用广泛,是治疗G-细菌感染的首选药物。

  1.3.1地塞米松的抗炎机制

  地塞米松是通过在可的松的9位碳原子上引进氟原子和16位碳原子上引进甲基等人工合成的[22]。氟原子的引入使地塞米松获得了更好的的脂溶性,它可以通过自由扩散穿越细胞膜而进入到细胞内。地塞米松被机体吸收后,被细胞内的糖皮质激素受体(GRs)识别,二者结合后受体的构象发生改变,激活生物功能部位,活化后的GRs可以抑制炎症细胞的转录活性,从而使炎症程度减轻[23]。

  1.3.1地塞米松的抗休克机制

  当动物内毒素感染病程发展至后期,通常会出现内毒素休克,导致全身血液粘稠度升高,血氧饱和度下降,组织缺血缺氧,导致动物死亡。

  地塞米松对休克可起到减缓作用。其抗休克疗效主要有两种发生机理。

  一个方面是稳定生物膜:发生休克时,由于微循环障碍使得溶酶体失去生物学功能,许多对身体正常组织有水解功能的酶在释放后没有办法被清除,从而作用于机体正常组织,导致正常组织和细胞被破坏[24]。另外,休克时发生的酸中毒,能使溶酶体酶的水解作用增强,进一步减少溶酶体的数量。大剂量地塞米松可以切断溶酶体酶的合成途径,能够使溶酶体在缺氧环境下更稳定,减少体内正常细胞的损伤,改善微循环[25]。

  另一个方面是保护心血管系统:大剂量地塞米松能直接作用于心肌细胞,增强心肌收缩力,增加心输出量,并对痉挛收缩的血管有解痉作用。地塞米松能使白细胞产生的氧自由基的功能明显抑制,从而保护心血管功能[26]。

  二、材料与方法

  2.1实验材料及仪器

  2.1.1实验试剂

  LPS、戊巴比妥钠购于西安瑞迪公司

  苏木精、伊红染液购于润昕实验仪器有限公司

  地塞米松购于力辰制药有限公司

  多聚甲醛、福尔马林购于山西康宝制药公司

  生理盐水为本实验室配制

  磷酸盐缓冲溶液(PBS)为本实验室配制

  其它常规仪器及试剂为本实验室保存。

  2.1.2实验动物及分组

  BALB/C小鼠42只,购于太原博锐动物技术公司。42只全部建立LPS诱导急性肺炎模型,将建立的病理模型中的18只用于建立病理评价分级标准(评价组),24只用于地塞米松治疗效果研究(治疗组)。

  2.1.3实验仪器

  医用手套、解剖板、手术刀、手术剪、肩头镊子、无菌试管、注射器为常规仪器。

  表1.实验仪器及型号

  仪器型号公司

  电热恒温箱

  高压蒸汽灭菌锅

  振荡器

  微量移液器

  TL-820系列冷冻切片机

  电子天平

  光学显微镜HN-60S

  DSX-18L

  DT96-4

  10-50ul

  TL-820C

  JY3003

  PMS-TM300力辰科技有限公司

  新华医疗器械有限公司

  江苏大唐医疗器械有限公司

  上海佳安分析仪器厂

  美国莫赛飞有限公司

  上海舜宇恒平有限公司

  东莞普密斯精密仪器有限公司

  2.2实验方法

  2.2.1试剂配制

  生理盐水:无菌条件下,用0.90克的氯化钠,100ml的蒸馏水配制生理盐水。

  戊巴比妥钠:0.22g戊巴比妥钠,10ml生理盐水,配制22 mg/mL戊巴比妥钠。

  LPS生理盐水稀释液:0.334gLPS,2L生理盐水,配制167μg/mL LPS生理盐水稀释液。

  4%多聚甲醛:4g多聚甲醛,100 PBS缓冲液,2滴1N的NaOH(pH7.4),60度水浴磁力搅拌。

  地塞米松注射液:1ml地塞米松磷酸钠水溶液,4ml生理盐水,配制10mg/ml地塞米松注射液。

  PBS(pH7.2~7.4)配制:7.9g NaCl,,0.2g KCl,,0.24g KH2PO4,溶于800 ml蒸馏水,用盐酸溶液将PBS的pH值调至7.2,定容至1 L,保存于4°C冰箱中。

  2.2.2建立病理模型

  1.麻醉:使用22 mg/mL的戊巴比妥钠对每只小鼠进行腹腔注射,50μL/只。10 min后肌肉紧张性降低,翻正反射维持,眼睑、踏板、吞咽反射消失,呼吸缓慢均匀即为麻醉成功。

  2.鼻咽滴注建模:将配制好的167μg/mL LPS生理盐水稀释液,经咽后壁滴入口腔1~2滴,(每只小鼠LPS滴注量约为10mg/kg体重),滴注后迅速且轻柔地捏住小鼠鼻孔,维持30~40 s,使小鼠将全部液体吸入气管内,然后听诊气管音,当出现轻微啰音即为造模成功。

  共建模42只小鼠。

  2.2.3建立病理学评价组

  小鼠肺部损伤病理学评价分级是指,在每只小鼠(本实验中用到18只)的肺组织切片中,每片肺叶挑取两个典型视野,进行光学显微镜检查,观察其损伤状态,并对损伤程度打分。建立病理学评价分级的目的是更客观、更直观、更准确的判断药物对病理模型的治疗效果。

  (1)肺部组织制片

  ①取材与固定:

  将建立的病理模型中的18只分为6组,每组3只,分别在建模后0h,3h,6h,12h,24h,48h(建立LPS在体内不同的感染时长,以模拟临床上病程的发展阶段)实施安乐死,打开胸腔,取出完整肺部。用4%多聚甲醛灌注,放入提前配制的固定液中(10%福尔马林),固定48 h以上,使内容物的蛋白质凝固变性。

  ②脱水透明:

  将组织块依次放入50%、70%、95%、无水乙醇中脱水。二甲苯是一种既溶于乙醇又溶于石蜡的有机溶剂,通常被用作透明剂。将脱水后的组织块置于二甲苯中透明,透明后进行浸蜡包埋。

  ③浸蜡包埋:

  取出透明完全的组织块,完全浸入融化的石蜡中,放置在保温箱内,待组织块充分浸满石蜡后,实施包埋。包埋时,将充分浸蜡的组织放入融化的液体石蜡中,保证石蜡对样本的完全包裹,冷却后为凝块状,即完成包埋。

  ④切片与贴片:

  将凝固的蜡块置于病理切片机中,由于切片机切下的切片有皱褶,直接贴在载玻片上会产生气泡,不利于镜下观察,因此需要对有褶纹的切片加热,使其平展,再贴片、烘干。

  ⑤HE染色:

  用到苏木精(Hematoxylin,H)和伊红(Eosin,E)两种染液。染色前,需先进行脱蜡,将切片放置于二甲苯中,将样品中的石蜡溶解,经由50%、70%、95%、无水乙醇洗去二甲苯,在蒸馏水中洗涤数分钟,进行染色。将脱去透明剂的样本放入苏木精水溶液中5min,放入0.50%伊红染液3min,流水冲洗30s,加入70%和90%酒精中脱水各10分钟。

  ⑥脱水透明:

  同上述第二步,重复进行一次。

  ⑦封固:

  将完成上述操作的样本覆盖一层中性胶,再将盖玻片由边缘到中间,慢慢覆盖于胶表面,避免产生气泡,影响观察。待完全风干,即可完成制作。

  (2)建立病理学评分等级

  将制作的肺组织切片置于光学显微镜下观察,观察内容包括:肺泡上皮细胞的损伤程度、中性粒细胞的浸润程度,肺泡壁增厚的程度、病灶大小所占视野肺片面积百分比。其中,统计病灶大小时,在低倍显微镜下(10倍)进行,其他项目可在高倍镜下进行。观察完毕后,对切片内容按损伤程度从低到高分为0~4级。

  2.2.4建立地塞米松治疗组

  将建立的病理模型中剩余的24只小鼠分为6组,每组4只,分别在建模后0h,3h,6h,12h,24h,48h给药,目的是模拟临床发病时,以同样的药物剂量(安全剂量)介入病程的不同发展阶段,从而得出最好的治疗时机及治疗效果。

  每组中,2只小鼠给地塞米松作为给药组,腹腔注射10mg/kg地塞米松注射液,另外2只作为对照组,腹腔注射10mg/kg PBS。给药24h后进行病理解剖,取全肺制作病理切片,并HE染色,方法同2.2.3中肺部组织切片制作。观察病灶面积、肺组织炎性细胞浸润、肺泡壁厚度、肺泡细胞变化,依照2.2.3中建立的病理学评价分级进行评估打分。

  鉴于大剂量地塞米松会引起小鼠不良反应,本实验采取安全剂量进行腹腔注射[27],即10mg/kg,以消除药物剂量不当引起动物其他疾病对实验数据的影响。