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论文相关方法-蜂王浆对小鼠血糖调节功能的研究
时间:2021-05-19 11:49:01

  构建高血糖小鼠模型1以四氧嘧啶灌胃小鼠十五天后测定血糖值大于11.11mmol/L则模型构建成功。构建高血糖小鼠模型2对其灌胃十五天后注射肾上腺素。将正常小鼠和高血糖小鼠模型分为两组,分别灌胃蒸馏水和蜂王浆十五天后对比体重代谢、血糖值和注射葡萄糖后的耐糖量。得出蜂王浆对小鼠血糖的影响。

  结果:蜂王浆对于正常小鼠和高血糖小鼠的体重代谢没有太大影响。通过蜂王浆对高血糖模型和正常小鼠模型的影响所得数据比较,蜂王浆对正常小鼠血糖无影响,对高血糖小鼠模型的血糖有降低作用。通过对正常小鼠模型和高血糖小鼠模型糖耐量的对比,蜂王浆有明显拮抗血糖升高的作用。

  结论:蜂王浆对于四氧嘧啶导致的血糖升高和肾上腺素导致的血糖升高有明显的拮抗作用,能够修复受损的胰岛β细胞,促进胰岛素分泌,促进肌糖原和肝糖原的合成,降低血糖。且对于正常小鼠的血糖没有较大的影响。并且蜂王浆作为食品具有一定的安全性。对于蜂王浆中具体的成分对血糖的降低还需进一步研究。

  蜂皇浆、蜂皇乳是蜂王浆的其他别名,是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂头部咽下腺和上颚腺的混合分泌物。在蜜蜂群中,主要用来作为蜂王和蜜蜂幼子的食物,蜂王的一生都在食用蜂王浆,工蜂和雄峰只在幼虫期的前三天将王浆作为食物。蜂王浆指的就是青年蜜蜂采蜜后分泌的一种像乳液一样的东西,此分泌的东西就像哺乳动物的乳汁并且具有很高的营养价值和很强的免疫功能而且含有特别高的长寿因子,蜜蜂和蜂王在刚出卵期是一样的,蜜蜂是孵化后吃三天蜂王浆以后改为吃蜂蜜或者花粉的长成的,而蜂王浆孵化后一生都在食用蜂王浆,蜜蜂一生的寿命在一个月到六个月左右而一直食用蜂王浆的蜂王一般能活五到七年左右。蜂王浆的颜色一般有乳白色和微黄色,它是因为蜜蜂采蜜的花粉不同而导致成分的改变。蜂王浆是唯一的胎儿级超级营养食品具有高级活性成分用来供用人体食用[1]。蜂王浆是一种具有广泛的生物学活性和药理活性的纯天然保健食品。长期以来,人们都在研究蜂王浆在医疗领域的应用。

  20世纪以来,随着分析化学技术的高速发展,蜂王浆的各种成分逐渐被人们认识。大量国内外学者对蜂王浆的成分有着充分的研究,并且发现它是一种复杂的天然食品。基本上生物体中所含有的成分它都具有,比如糖类、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素等[2]。并且因为其地理原因、气候问题等差异,不同的地域的蜂王浆的成分之间的含量都有所差异。但蜂王浆的生物活性却都一样,例如提高机体的免疫能力、改善人体脂肪代谢、降血脂、降血糖的作用等[3]。通过了解蜂王浆具有降血糖的作用,因此本文主要研究蜂王浆对小鼠血糖的调节作用。

  1.1.2高血糖特征概述

  糖尿病的特征是一种以高血糖为主的内分泌紊乱的代谢性疾病[4]。高血糖则是因为分泌的胰岛素减少或者其生物作用受到破坏,或者两者兼有而引起。糖尿病的病人长期存在高血糖的现象,导致各种身体组织和器官,特别是眼睛、肾脏、血管等受到长期性的损伤、功能作用障碍。现今社会,糖尿病发病率日益增加,糖尿病已经开始对人类身体健康安全造成重大威胁[5]。越来越高的发病率并且导致的并发症,严重影响患者的身体健康和生活质量。目前的降糖药有很多,但是是药就会有多少的副作用,血糖高本来就很容易伤到肝脏,如果没有用到合适的药物,就会更加刺激肝肾,对人体造成危险。因此,对于糖尿病的防治应该进一步得到研究。实验证明:活性蜂王浆有着很好的降低血糖的功能[6]。近年来人们通过对蜂王浆降血糖的研究,已经取得了令人瞩目的成果。因此本文通过对蜂王浆进一步的研究,来深入了解其降血糖的机理[7]。

  1.2国内外研究现状

  近年来,随着社会的快速发展和人们生活水平的提高,人们得糖尿病的可能性也来越高[8]。世卫组织(WHO)最新提供的数据显示,世界上糖尿病患者的总数从1990年的1.21亿升高到2015年5.32亿[9]。糖尿病是一种慢性血糖升高的代谢疾病。导致糖尿病的主要原因是身体中分泌的胰岛素不足和胰岛素的作用减弱[10]。常用于治疗糖尿病的药物有很多,例如二甲双胍、噻唑烷二酮类、DPP-4抑制剂等。这些药物只能暂时缓解糖尿病的症状,但是却没有根治糖尿病。国内外大量研究,蜂王浆对于降低血糖有着极好的作用。

  蜂王浆是一种仅仅次于蜂蜜的一种蜂产品,应用的历史十分悠久,应用在很多的领域中[11]。科技的发展使得人们对蜂王浆的认知达到了一个新的高度。通过相关文献的查阅,发现十九世纪六十至八十年代,法国、德国、美国、意大利等国相继对蜂王浆做了临床上的应用[12]。糖尿病患者的空腹血糖值需要保持在一定范围内之内。但是市面上大部分降糖药物都会对人体产生副作用,会导致人体内分泌紊乱,肝肾功能下降等。蜂王浆是一种天然的食品,国内外大量研究表明蜂王浆能够积极的调节血糖。并且作为食品对于人的身体健康没有任何影响。在降低血糖的同时,也能够为人们的身体补充营养。

  1.3研究内容及目标

  本研究构建了两种实验型高血糖小鼠模型和正常小鼠模型,高血糖模型组1用四氧嘧啶高血糖小鼠灌胃,分为两组即为受试组和正常组分别灌胃蜂王浆和蒸馏水。再将高血糖模型组2分为两组,受试组用蜂王浆灌胃,对照组用蒸馏水灌胃后,最后灌胃相同的肾上腺素,分别与正常小鼠模型组比较。对比体重代谢、血糖和耐糖量,得出蜂王浆对高血糖病人是否起到降糖的作用。通过本实验研究蜂王浆可使四氧嘧啶,肾上腺素所引起的血糖升高得小鼠的血糖降低,并且对正常小鼠的血糖值没有明显影响。对高血糖小鼠和正常小鼠的体重代谢影响不大,说明蜂王浆作为食品安全性很高。并且蜂王浆对于小鼠的耐糖量有所提高,能显著拮抗灌胃葡萄糖后带来的血糖升高。最后通过毒理试验,表明其最大耐受量。

  1.4论文组织结构

  对此次试验的研究,选取蜂王浆对小鼠试验,并通过学习相关知识来对蜂王浆是否能够达到对高血糖小鼠血糖降低的预期效果。此次试验研究主要考虑几个方面,首先是研究蜂王浆对正常小鼠和高血糖小鼠的体重代谢有无影响来证明蜂王浆作为食品的安全性。其次是蜂王浆对正常小鼠的血糖值有无影响,以及对于四氧嘧啶型高血糖模型小鼠的血糖有无降低血糖的作用,再接着有蜂王浆对注射肾上腺素后所致的小鼠血糖升高有无降低的作用。接着是测定灌胃蜂王浆的小鼠与没有使用蜂王浆的小鼠对灌胃葡萄糖后的影响有无拮抗作用。最后是测定蜂王浆的最大耐受量确定其安全性。通过试验得到验证。

  2试验材料与方法

  2.1试验材料

  2.1.1动物

  本研究以18~22g昆明系雄性健康小白鼠为试验动物,共40只,由山西医科大学动物中心提供。

  2.1.2药品及试剂

  蜂王浆:购于广济堂药店。

  四氧嘧啶、盐酸肾上腺素注射针剂、葡萄糖液体试剂盒:购于山西医科大学。

  2.1.3主要仪器

  强生One Touch Horizon随手测血糖仪以及配套试纸;1ml灌胃针;毛细玻璃管。

  2.2试验动物分组

  将30只小鼠随机分为三组,每组10只,分别为正常组、四氧嘧啶型高血糖小鼠(高血糖模型组1)、肾上腺素型高血糖小鼠(高血糖模型组2)。每组再随机各分为两组,分为受试组和对照组。详细用药情况见表2-1。

  表2-1试验设计与分组情况

  组别四氧嘧啶(mg/kg×7d)盐酸肾上腺素(μg/kg)蒸馏水(mg/kg×15d)蜂王浆(mg/kg×15d)

  正常组-对照0 0 500 0

  正常组-受试0 0 0 500

  模型1组-对照150 0 500 0

  模型1组-受试150 0 0 500

  模型2组-对照0 240 500 0

  模型2组-受试0 240 0 500

  2.3试验设计

  2.3.1对正常组小鼠的影响

  选取18~22g的正常小鼠10只,随机分为两组,分别为受试组和对照组。每天灌胃相应的药物,受试组灌胃蜂王浆,正常组灌胃蒸馏水,蜂王浆给药体积为500ml/kg。蒸馏水也灌以同样的剂量。每日一次,连续15天。体重测定:在给药前一天称取体重,并分别在给药后第7天和第15天各称取体重一次。血糖测定:第一次灌胃相应药物2小时末测血糖值。两组连续灌胃15天后,末次给药前禁食9小时,正常给两组小鼠饮水,给药后3小时,测血糖值。糖耐量:最后一次眼眶静脉采血后测血糖值。然后再灌胃20%葡萄糖溶液(0.1ml/10g)。在注射葡萄糖溶液观察小鼠变化0.5小时和2小时后采血测血糖值。记下数据,填入表格。

  2.3.2对四氧嘧啶型小鼠的影响

  随机选取所准备的小鼠10只,禁食24小时后,以每次150mg/kg的剂量对小鼠腹腔注射四氧嘧啶,注射7天后,暂停摄食5小时,测定血糖值。血糖值大于11.11mmol/L则可进行下步实验。将这10只合格的小鼠随机分为两组,分别为受试组和对照组。受试组每天都灌以相应剂量蜂王浆,对照组给予同样剂量的蒸馏水。连续给药15天。体重测定:在建模前称得小鼠体重1次,第7天、第15天后分别称取小鼠体重各一次。血糖测定:第一次给药2小时末测血糖值。受试组和对照组都连续灌胃15天后,末次给药前禁食9小时,正常饮水,给药后3小时,测血糖值。糖耐量测定:最后一次测血糖后。然后灌胃20%葡萄糖溶液(0.1ml/10g)。灌胃后对小鼠进行观察0.5小时和2小时后采血测血糖值。记录数据。

  2.3.3对肾上腺素型小鼠的影响

  选择正常健康的小鼠10只,随机分为受试组和正常组两组。受试组每天以500mg/kg剂量的蜂王浆灌胃一次,正常对照组每天同一时间以蒸馏水灌胃一次。连续给药15天,最后一次给药前禁食10小时,末次给药2h后,都以240μg/kg肾上腺素注射腹腔。体重:因肾上腺素型小鼠体重短时间不会太大变化,所以不采用肾上腺素型小鼠的体重数据。血糖:第一次给药前测定血糖值。末次给药2h后注射肾上腺素30分钟后眼眶后静脉采血。糖耐量:注射肾上腺素30min后测得血糖值后,灌胃20%葡萄糖溶液(0.1ml/10g),0.5小时和2小时后分别眼眶静脉采血。最后测定血糖值。然后记录数据填入表格。

  2.3.4急性毒性试验及最大耐受量测定

  蜂王浆毒性很小[12],所以无法测定半数致死量LD50,因此为了确定其安全性需要测定它的最大耐受量。根据预计试验的结果,选取小鼠10只,随机分为两组,即受试组和对照组,每组各5只。在实验前禁食14小时同时自由饮水。受试组用最大体积0.8g/mL的蜂王浆灌胃1mL。对照组用与受试组灌胃蜂王浆相同剂量的蒸馏水灌胃。每8h灌胃一次,连续7天,给药后观察动物的行为活动,外观,进食情况,精神有无大的波动,大小便及其颜色,口,鼻,眼有无分泌物及死亡等。如果有死亡,应立即进行尸检。如果发现病变器官,需要做病理组织学检查。

  2.4检查指标及方法

  (1)体重:测定前将动物编号,按照编号逐个进行。测定前将电子秤固定好,用一个固定容器放在电子秤上。将电子秤放平对电子秤作去皮重量,回零调整。抓取已经编号的小鼠逐个放入专门用来装小鼠的容器内,读取电子秤上显示的小鼠体重并记录。

  (2)血糖:将动物按编号逐个从饲养笼中取出,左手拇指和食指抓取小鼠双耳以及颈后皮肤,轻轻按压颈部两侧,眼眶后静脉充血严重后,以45°角用针从内眼角刺入,并且向下旋转,将血液流到试纸上。将试纸插入血糖仪,调节code到相应血糖试纸编号,5秒后显示血糖值。

  2.5数据处理

  采用SPSS 17.0进行数据处理,结果以平均数±标准差表示,显著性检验采用t检验。

  3结果与分析

  3.1对体重的影响

  结果见表3-1,建模前各组的体重差异都在20g左右(P>0.05)。建模后,正常对照组体重增长了10g,正常受试组增长了10.4g高血糖1受试组增长了8.6g,没有显著性的差异(P>0.05)。而高血糖1对照组减少了2.1g,与正常对照组的差异显著(P<0.01)。和高血糖对照组比较,各组的体重都增长了很多。但是与正常组的对照组相比较,除了高血糖对照组外,各组建模前后体重差异都很大,并且与正常对照组的体重增长差异不大(P>0.05),而且受试组各组小鼠在试验期间的皮毛也有较好的光泽。

  表3-1:蜂王浆对小鼠体重的影响

  组别个体数第1d第7d第15d

  正常对照组5 19.8±3.4 24.8±3.5**29.8±3.2**

  正常受试组5 20.1±3.6 24.8±3.5**30.5±3.4**

  高血糖1对照组5 20.3±3.2 19.3±4.1##18.2±3.9##

  高血糖1受试组5 20.5±4.2 24.5±3.6**29.1±3.6**

  注:与高血糖对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与正常对照组相比#P<0.05,##P<0.01

  3.2对血糖的影响

  由表3-2可知,正常受试组小鼠在连续灌胃蜂王浆15天后血糖为5.84mmol/L与正常对照组十五天后血糖为6.28mmol/L没有太大差异(P<0.05)。高血糖模型1组中受试组灌胃蜂王浆连续15天后的四氧嘧啶小鼠血糖有所降低,降低了3.32mmol/L(P<0.05,P<0.01),而四氧嘧啶型对照组小鼠血糖没有降低的表现。由高血糖模型2组对比可见,小鼠腹腔注射肾上腺素后,从两组小鼠的血糖值可以看出,肾上腺素有明显提高空腹小鼠的血糖值,受试组小鼠能明显拮抗小鼠升高的血糖(P<0.05)仅提高了4.01mmol/L,而对照组却没有显著拮抗升高的血糖,提高了7.19mmol/L。

  表3-2:蜂王浆对小鼠血糖的影响

  组别个体数剂量(mg/kg×15d)给药前(mmol/L)给药后(mmol/L)

  正常对照组5 0 6.34±0.41 6.28±0.43

  正常受试组5 500 5.92±0.50 5.84±0.49

  高血糖1对照组5 0 20.83±3.68**21.89±3.02**

  高血糖1受试组5 500 20.96±5.02 17.65±5.10

  高血糖2对照组5 0 5.83±1.25**13.02±2.08**

  高血糖2受试组5 500 5.95±1.16*9.96±2.37*

  注:与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01

  3.3对糖耐量的影响

  由表3-3可知,各组注射葡萄糖后,0.5小时血糖值达到最高,随后逐渐下降。与正常对照组相比,正常受试组0.5h血糖升高了0.6mmol/L、高血糖1受试组血糖升高了0.87mmol/L、和高血糖2受试组血糖升高了0.83mmol/L对葡萄糖引起的血糖增高有明显的拮抗作用。并且起效较快(0.5h),可以明显的改善耐糖量。而高血糖1对照组血糖升高了1.69mmol/L、高血糖2对照组血糖升高了1.81mmol/L却对于葡萄糖引起的血糖升高没有明显的拮抗作用。

  表3-3:蜂王浆对小鼠糖耐量的影响

  组别个体数血糖值(0h)血糖值(0.5h)血糖值(2h)

  正常对照组5 5.48±1.52 8.35±2.46 6.40±1.26

  正常受试组5 5.93±1.45 6.53±1.32 6.09±1.72

  高血糖1对照组5 21.89±3.02 23.58±1.67 22.01±2.06

  高血糖1受试组5 17.65±5.10##18.52±4.31##17.89±4.67##

  高血糖2对照组5 13.02±2.08 14.83±1.96 13.52±1.87

  高血糖2受试组5 9.96±2.37#10.79±2.28#10.53±2.78#

  注:与正常对照组相比,#P<0.05,##P<0.01

  3.4对小鼠急性毒性实验

  10只小鼠灌胃当天精神正常,皮毛光滑,活动、进食、饮水、粪便正常。1周内没有死亡及其异常现象。七天后处死并解剖,肉眼观察心脏、肺、肾脏等器官均未发现异常。表示蜂王浆的最大耐受量可以达到60.00g/kg。

  3.5分析

  本实验用正常小鼠,四氧嘧啶模型小鼠,肾上腺素模型小鼠,给其灌胃蜂王浆,其结果表明:

  (1)从实验结果表3-1,表3-3来看,高血糖能使小鼠体重降低,蜂王浆对正常小鼠的体重增长没有明显的影响,对正常小鼠的糖耐量有所加强。所以这表明蜂王浆作为保健品具有一定的安全性。不管是不是高血糖患者都能服用,并且蜂王浆具有很大的营养性。

  (2)从实验结果表3-2来看,蜂王浆对四氧嘧啶和肾上腺素所致的高血糖模型小鼠有显著的降低血糖的作用。对正常小鼠的血糖没有特别明显的影响。这表明蜂王浆对高血糖症有明显的降低血糖的作用,并且对低血糖或正常血糖小鼠的血糖没有降低的作用,能够维持正常小鼠血糖的稳定。因此蜂王浆对低血糖症的使用也十分安全。

  (3)四氧嘧啶能够使胰岛β细胞遭到破坏,造成动物分泌的胰岛素太少,是一种实验型的糖尿病模型,注射四氧嘧啶后小鼠的血糖一直会升高,因此塑造一个很好的高血糖小鼠模型。从表3-2可以看出,蜂王浆对四氧嘧啶致血糖升高的小鼠的血糖有一定的降低作用。表明蜂王浆能一定程度的修复四氧嘧啶所导致的细胞和组织,修复已经受损的β细胞,促进胰岛素的分泌和β细胞的再生。能够抑制四氧嘧啶对小鼠β细胞的损伤,使细胞恢复到良性的循环,有效降低小鼠的血糖。

  (4)肾上腺素是一种能够升高血糖的重要激素。肾上腺素能够促进肝脏糖原以及肌肉糖原的分解,促进糖异生使血糖升高。小鼠腹腔注射肾上腺素,受试组注射蜂王浆能够显著拮抗肾上腺素所导致的血糖升高。这应该与促进肝脏糖原和肌肉糖原的合成,抑制糖异生有关。

  (5)从实验结果表3-3可以得出,灌胃蜂王浆的小鼠能够显著拮抗外源性葡萄糖所带来的血糖升高,所以蜂王浆具有能够直接增强机体糖代谢的作用,阻止动物肠道对葡萄糖的吸收。

  (6)从毒理实验可得,蜂王浆的副作用很小。其中的成分含有大量的营养物质,且主要作用是降低血糖作用。

  以上是蜂王浆对小鼠血糖调节的各种影响,从糖尿病人长远的身体健康和保健要求来看,蜂王浆能够作为一种降血糖的保健品和药品。本实验可以为临床提供一些依据,但是动物的实验结果和人体存在着一定的差异,所以蜂王浆应用于人体的降血糖功能有待于进一步的临床研究。除此之外,蜂王浆还具有很多其他的功能,如降血脂、抗菌消炎、改善贫血等。本实验只讨论了蜂王浆的降血糖功能,其他的保健功能也需要进一步的研究。