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论文案例分享-新颖细胞因子在结直肠癌和乳腺癌发生发展中的机制
时间:2021-03-31 10:31:00

  探究新颖细胞因子白细胞介素38(IL-38)在不同肿瘤和正常组织中的表达情况,通过团队早期探究IL-38在结直肠癌中的作用并结合此次结直肠癌动物模型实验中得到的结果作为理论基础,指导探究IL-38与作为对照指标的白细胞介素36(IL-36)、白细胞介素37(IL-37)在乳腺癌癌组织和非癌组织中的表达情况,判断其是否可以作为具有临床指导意义的生物标记物,其表达水平是否对乳腺癌患者术后生存时间和预后有影响,以及是否可以为临床治疗和诊断乳腺癌提供新的靶点。

  1.1研究背景及意义

  世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报道,癌症仍然是全球世界上第二大死因,每年导致约880万人的死亡[1]。从全球的情况来看,近六分之一的死亡原因是癌症所造成的。这五种行为和饮食约占三分之一的癌症死亡原因:使用烟草、大量饮酒、缺乏运动、水果和蔬菜的摄入量低和高体重指数。然而临床表现出现较晚无法从早期获得最好的治疗、患者预后情况差等都是癌症死亡率居高不下的主要原因[1]。

  1.1.1结直肠癌

  结直肠癌,全球发病率第三,死亡率第二的肿瘤疾病[2]。发病率随年龄的增长逐渐增加,特别年龄大于50岁的人群发病率显著增加[2]。在中国,由于饮食与生活习惯的改变,结直肠癌的发病率与死亡率逐年增加[3]。据中国国家癌症登记中心(National Central Cancer Registry of China,NCCRC)2015年公布的数据可知:在中国男性因结直肠癌导致死亡的肿瘤位居第五位,而女性则位居第四[3]。有数据显示,在经济较发达的地方结直肠癌的发病率更高[3,4]。其中中国东南沿海地区的死亡率明显高于中国中西部地区[3]。中国的结直肠癌的发病率与死亡率与世界其他国家相比,死亡率则高于大部分国家。

  早在2017年由美国癌症研究协会(American Institute for Cancer Research,AICR)报告的结果显示:大量饮酒、体脂含量过高、食用过多的工厂加工肉等都可以增加结直肠癌的发病率[5,6]。通过文献我们发现大量饮酒和吸烟都增加了患结直肠癌的风险和几率。酒精进入结肠会被结肠内的微生物分解代谢成乙醛,并通过在体内降解叶酸起到促进结直肠癌的发生[7]。而香烟中的有害物质通过烟雾的方式直接增加结直肠癌的发病率和死亡率[8]。

  除了环境因素和饮食习惯可增加结直肠癌的发病率和死亡率,遗传因素同样是造成结直肠癌高发病率的一个重要因素。遗传性结直肠癌是结直肠癌因遗传因素导致患病的一大类,大致可分为两种:遗传性非息肉病性结直肠癌(Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer,HNPCC)和遗传性息肉病性结直肠癌(Hereditary Polyposis Colorectal Cancer,HPCC)。HNPCC是一种常染色体显性的癌症综合征,发病率占结直肠癌总发病率的4%左右[9],而HPCC占其总数的5%左右,就全世界人口总数而言,每一百万中就有5-9例罹患HPCC的患者[2]。

  由于结直肠癌起病缓慢和不易在早期发现等特点,导致了其死亡率高居不下的主要原因。约有50%的患者无法在出现症状之前确诊,致使病情的恶化和不可控,最后导致其5年生存率仅为12%[10]。近几年结直肠癌的死亡率已经与早些年相比有着巨大的进步和突破,这都依赖于早期筛查的渐渐普及和人们对健康意识的提高,早发现、早治疗会大大降低结直肠癌的死亡率。而手术、化疗和放疗仍然是治疗结直肠癌最有效最主流的治疗方法[11,12]。

  随着医学的不断进步,我们发现精准医疗的突破大大降低了肿瘤患者死亡率。化疗联合靶向治疗等技术的不断成熟及应用是在未来医治肿瘤患者并降低死亡率重要的一步[13]。

  1.1.2乳腺癌

  乳腺癌是世界上女性关注的主要健康问题之一,也是导致女性癌症死亡最常见的原因。2018年,超过200万女性被诊断患有乳腺癌,超过50万女性死于这种疾病[2]。乳腺癌不仅是全球范围内第二大常见的癌症,在中国乳腺癌也是导致女性死亡最常见的疾病[14,15]。国际癌症研究机构(IARC)预测:在2020年,中国女性患乳腺癌的确诊人数和死亡人数将达到215,800和57,500[16]。乳腺癌早期患者病情发现晚、诊出率低等都导致了乳腺癌诊断的不及时和病情的延误,从而导致了肿瘤的进一步恶化和不良的预后。而最基本的问题就是癌症筛查的不及时,以及筛查手段的不完善。尽管在过去的几年里,乳腺癌的诊断和治疗都有着突破性的进展,但仍然缺少着可靠的用于早期筛查和预测预后生存情况的生物标志物。

  由于近几年中精准医学的不断发展、对癌症筛查的普遍认可,以及外科改良手术等更加完善的手术方法,这大大的降低了乳腺癌相关的死亡率。由美国癌症协会(ACS)提供统计数据显示,浸润性乳腺癌女性的平均5年生存率为90%。10年平均生存率为83%。如果仅在乳腺中发现癌症,则乳腺癌女性的5年生存率为99%。62%的乳腺癌患者被诊断出患有此阶段。如果癌症已扩散到局部淋巴结,则5年生存率为85%。如果癌症已扩散到身体的远处,则5年生存率仅为27%[17]。由此可见,如果我们拥有可靠的早期筛查和预测预后生存情况的生物标志物,则可以尽可能的避免乳腺癌扩散和转移。

  在肿瘤学中我们得知,身体的正常组织具有有限的生长促进和调节,这有助于保持组织的结构和功能。然而,癌细胞具有延长和慢性增殖的特点[18]。乳房是一个复杂的小管肺泡器官,固定在一个不对称的结缔组织内[19],经历一系列从育龄到衰老的变化。典型的乳房结构包含一层复层上皮,由基底膜为边界,固定在血管、淋巴和间质细胞的模板中[20]。乳腺癌是一种在乳腺细胞中起始的恶性疾病。像其他恶性肿瘤一样,其病因复杂多样,有多种危险因素会增加患乳腺癌的可能性。

  乳腺癌与环境因素有着密切的关系,而通常由于遗传因素和环境因素之间的共同关联而发生的。脱氧核糖核酸(DNA)的损伤和遗传性状改变可以指导乳腺癌与雌激素的暴露。有乳腺癌家族史的患者,可能继承了DNA和P53,BRCA1和BRCA2等基因的缺陷,因此有发展为乳腺癌的可能性[21]。

  近些年免疫学的飞速发展,让我们能在免疫的角度上重新指导,并且解读癌症的发生。乳腺癌与免疫同样有着非常密切的关系,RAS/MEK/ERK途径和PI3K/AKT途径保护正常细胞免于细胞自杀。当参与这些保护性途径编码的基因发生突变,或者当不再需要这些基因时,细胞就不能自杀,从而导致癌症的发生。机体免疫功能正常时,可发现具有受损的脱氧核糖核酸(DNA)的癌细胞并将其清除。而机体异常的免疫功能,可导致其免疫防御和监视功能失灵,最终导致乳腺癌的发生[22]。

  1.2研究现状

  白细胞介素是分泌型免疫调节蛋白,属于细胞因子超家族,并且作为细胞因子,呈现复杂的免疫功能。白细胞介素的主要目的是介导免疫系统中细胞间的通讯,包括细胞迁移,增殖,成熟和粘附[23]。

  白细胞介素36(Interleukin-36,IL-36)、白细胞介素37(Interleukin-37,IL-37)和白细胞介素38(Interleukin-38,IL-38)同属白细胞介素1(Interleukin-1,IL-1)家族新成员。IL-1家族有许多成员都参与着不同的炎症和免疫性疾病,IL-36、IL-37和IL-38均为家族中的炎性因子。

  IL-36家族包括三个成员,分别为IL-36α、IL-36β和IL-36γ并且都共享着相同的受体复合物,该复合物由IL-36受体(IL36R/IL1RRP2/IL1RL1)和IL-1受体辅助蛋白组成。IL-36细胞因子在人体多处有所表达包括结肠、肺和皮肤等,并通过巨噬细胞、单核细胞、T细胞等免疫细胞所表达[24,25]。IL-36是炎症反应里IL-1家族中相对成熟的激活剂,可刺激先天和适应性免疫反应[25]。虽然IL-36是炎性细胞因子,但同样也是抑制肿瘤的抑癌因子。最开始的研究是IL-36可癌抑制黑色素瘤起到抗肿瘤的作用,特别是它可以增强CD8+T等细胞的功能,使在肿瘤微环境中肿瘤细胞可以变成一种易于破坏的细胞,从而起到抑制肿瘤发生的作用[26]。

  IL-38属于IL-36细胞因子组,其基因位于染色体2q13-14.1,位置接近IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)基因和IL-36受体拮抗剂(IL-36 receptor antagonist,IL-36Ra)基因,且与以上两个基因高度同源,与IL-1Ra蛋白有41%同源,与IL-36Ra蛋白有43%同源。Mora等人发现,IL-38在坏死、凋亡或炎症环境中分泌,并发挥抗炎症特性,尤其是在巨噬细胞上,可以抑制Th17成熟[27,28]。IL-38与这些受体结合,阻止激动性配体结合,与此同时抑制后续的信号传导途径,从而通过外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、人白血病单核细胞系(THP-1s)、巨噬细胞和树突状细胞发挥抗炎作用抑制Th1和Th17的激活和功能并促进Treg的扩增[28-30]。

  IL-37是一种双重功能的细胞因子,不仅可作为核转录因子,也可以通过与细胞表面的受体结合来激活信号传导途径[31,32]。有研究显示IL-37参与炎症性关节炎的发生与发展,在痛风性关节炎的患者发病时,IL-1家族成员的促炎因子如白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)等因子表达水平就会升高;而再非发病期间,抑炎因子如IL-37的表达量就会升高[33]。

  根据大量文献我们已经知道IL-36α可作为结直肠癌患者术后生存时间的独立因素,并且IL-36α的低表达与结直肠癌患者预后较差有着明显的相关性[34],并且根据我们前期实验基础已经可知,IL-36和IL-38与结直肠癌都呈现了明显的相关性。IL-36γ的表达量可能是预测早期结直肠患者术后生存时间的生物标记物,但IL-36β在结直肠癌中的表达对结直肠癌的发生发展没有太大的影响[35,36]。癌组织中IL-38的表达量不仅是判断结直肠癌患者预后的十分灵敏的标志物,还是独立预测结直肠癌患者术后生存时间的指标[36]。通过本次研究我们依据动物实验深入探究证实IL-38在结直肠中所发挥着保护机制,并根据IL-38在结直肠癌中的作用去指导探究IL-38是否在乳腺癌中有着与在结直肠癌中相同的抑制肿瘤的机制。

  1.3研究思路

  图1.1本次实验技术路线图

  如图1.1所示:首先构建物模型实验的基本思路和构架。用AOM/DSS去诱导IL-38 KO小鼠构建结直肠癌模型,在小鼠患结直肠癌基础上验证IL-38的表达在结直肠癌中的作用,并为探究IL-38在乳腺癌中表达的作用并作为理论基础。之后收集大量的乳腺癌患者临床数据整理成表格资料,作为基础临床资料为之后实验结果分析打下基础。根据之前收集的乳腺癌病理临床资料,找出对应患者的病理切片。在切片上找出患者乳腺癌癌组织和正常组织或切缘(非癌组织)有代表性的区域之后,通过对应的病理切片找出对应患者的蜡块组织,进行组织芯片的制作。把制作好的组织芯片切成组织芯片切片,通过免疫组织化学的方法对其染色,并得到最终的切片。利用Olympus BX63光学显微镜拍照,之后使用Image-pro Plus 9.1软件来量化IL-36、IL-37和IL-38在癌组织与非癌组织中的表达量。根据乳腺癌患者的临床病理资料,分析患者临床病理特征和IL-36、IL-37和IL-38表达量之间的关系。运用ROC曲线来判断IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌患者癌组织与非癌组织中的表达量的敏感性和特异性。通过收集到的乳腺癌患者术后随访资料,用GraphPad prism 8来制作生存曲线,分析患者生存时间与IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌患者癌组织与非癌组织中表达量的关系。通过得出的数据结果,我们进一步的探究IL-38和作为对照指标的IL-36、IL-37在乳腺癌的发生和发展中起到的作用,并为未来乳腺癌的治疗和预后提供了新的思路。

  1.4实验设计

  1.4.1动物实验

  1.4.1.1 AOM/DSS诱导IL-38 KO小鼠结直肠癌模型的构建及取材

  (1)AOM/DSS分别诱导IL1f10 KO(IL-38 KO)小鼠和野生型(WT)小鼠,记录体重并测得每只小鼠DSS诱导期间的粪血分数。

  (2)三个月模型构建成功后开始取材,取小鼠全血、肝、脾、肠系膜淋巴结和结肠。

  (3)拍照并记录结直肠长度、重量,肿瘤数量、大小,以及肝、脾的重量。

  1.4.2免疫组化实验

  1.4.2.1收集乳腺癌临床病理数据

  (1)收集乳腺癌患者的基本临床病理资料:姓名、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况、肿瘤位置、激素表达情况。

  (2)收集乳腺癌患者的术后随访资料:是否死亡、手术时间、随访时间、生存天数。

  (3)收集对应乳腺癌患者的HE病理切片和蜡块。

  1.4.2.2实验步骤

  (1)将收集的蜡块制作组织芯片,以厚度为4μm将组织芯片切成白片。

  (2)将组织芯片白片置于80度烤箱30分钟后,进行免疫组织化学染色。

  (3)将制作好的免疫组化组织芯片切片置于Olympus BX63光学显微镜下,使用60倍空气镜进行观察并拍照,每张芯片下的每一块组织拍30-50张图片。

  1.4.3分析数据

  (1)使用GraphPad Prism 8绘制IL-38 KO小鼠与WT小鼠体重与基础体重相比的百分比变化图。

  (2)用t检验判断IL-38 KO小鼠与WT小鼠在共同诱导构建结直肠癌模型期间体重之间的差异。

  (3)用t检验判断IL-38 KO小鼠与WT小鼠之间粪血分数、结直肠长度、结直肠重量、肿瘤数量、肿瘤大小、脾脏重量和肝脏重量之间的差异。

  (4)将拍好的图片用Image-pro Plus 9.1软件,分析每张照片上的IL-36、IL-37和IL-38蛋白染色部分,并对其进行定量分析,之后求得每个患者的阳性表达量的平均值。

  (5)用Mann Whitney检验法判断乳腺癌癌组织与非癌组织之间表达量的差异。

  (6)使用one-wayANOVA和Brown-Forsythe and WelchANOVA检验法判断多组数据之间表达量的差异。

  (7)使用ROC曲线判断IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌癌组织与非癌组织中表达量的敏感性与特异性。

  (8)用乳腺癌患者的随访资料和GraphPad prism 8制作生存曲线,用log-rank检验法分析IL-36、IL-37和IL-38在癌组织和非癌组织中表达量与乳腺癌患者生存时间之间的关系。

  1.5采用的技术方法与手段

  1.5.1小鼠取材要求

  小鼠出现腹泻、血便、脱肛等结直肠癌相关症状后,可以进行取材。首先使小鼠吸入乙醇后摘眼球取血、血清分离、冻存。之后脱髓处死,将小鼠固定在操作台上,分别取小鼠肝、脾、肠系膜淋巴结和结肠。将结肠剖开后用PBS清洗,测量结肠长度;记数肿瘤数、测量肉眼可见肿瘤的最长径和最短径,计算肿瘤面积;对每一个结肠大体拍照(肠管平铺,肿瘤暴露、肠粘膜保湿)。

  1.5.2制作组织芯片

  根据的乳腺癌患者的基本信息找出相对应的病理切片,在光学显微镜下找出并画出乳腺癌癌组织与非癌组织具有代表性的区域,然后根据做标记的病理切片找出相与之匹配的病理蜡块,然后根据病理切片上的区域同样画在病理蜡块上,之后以直径为2mm取出组织放入组织芯片蜡块里,最后切片并制作组织芯片白片。

  1.5.3免疫组织化学染色

  进行免疫组化学染色,将组织芯片白片置于80度烤箱30分钟,然后脱蜡,之后用修复仪98度修复30分钟,加过氧化物酶阻断剂,用reaction buffer每30分钟洗一次,之后加一抗和二抗,最后显色封片。

  1.5.4 Olympus BX63光学显微镜拍照

  用制作并染色完成的组织芯片进行拍照,对每张切片上的每个组织区域都进行30-50张按照顺序拍照,尽可能的不漏掉每一个区域,所有的照片选用同一个白平衡数值和同一台显微镜。

  1.5.5 Image-Pro Plus 9.1对IL-36、IL-37和IL-38表达量定量进行分析

  在拍摄的组织芯片切片照片中选取最具代表性的照片,对其具有免疫组织化学阳性的区域作为目标测量有效统计区域的面积、计算光密度平均值、累计光密度值,得到的数据为每位乳腺癌患者其阳性表达量的平均值,最后我们通过软件的统计学方法,判断IL-36、IL-37和IL-38的表达量在乳腺癌癌组织和非癌组织之间是否存在显著的差异和统计学意义。

  第2章综述

  白细胞介素36、37和38与肿瘤发生发展中作用的研究进展

  摘要:癌症仍然是世界上导致人类死亡的一大因素,世界卫生组织(WHO)发布的数据显示,每年因为癌症死亡的人数约900万人。而结直肠癌和乳腺癌占据癌症发生率中很大的一部分,让医学领域的学者和医疗人员备受关注。近些年发现了几种新型细胞因子,并且研究显示他们都可能参与肿瘤的发生与发展。白细胞介素36(IL-36)白细胞介素37(IL-37)和白细胞介素38(IL-38)均为白细胞介素1(IL-1)家族新成员并呈现着复杂的抗肿瘤机制。本文针对IL-36、IL-37和IL-38在结直肠癌和乳腺癌中可能产生的作用进行综述。

  关键词:IL-36;IL-37;IL-38;结直肠癌;乳腺癌

  在中国,结直肠癌和乳腺癌的发病率逐年提高,原因是肿瘤生长的复杂机制导致在治疗阶段无法有效的消除肿瘤细胞,这给结直肠癌和乳腺癌患者在治疗和预后的阶段上造成了很大的困难。很多学者不再认为这些疾病是一种单一的肿瘤类型,而是一组疾病亚组[37]。由于对癌症生物学有了更好的了解,并引入整合了分子生物标记物,通过对患者的某些特定的靶点进行引导和治疗,在很大程度上使得精准医学近些年飞速发展,精确治疗的时代也逐渐揭开序幕。本文我们初步探索IL-36、IL-37和IL-38可否作为在结直肠癌和乳腺癌的治疗靶点进行综述。

  2.1结直肠癌和乳腺癌概述

  2.1.1结直肠癌的病因与机制

  结直肠癌是全球范围内发病率第三高的癌症,而且死亡率全球位居第二[2]。在中国因结直肠癌死亡的患者人数也排在前五[3]。结直肠癌的病因也复杂多样,除了大量饮酒、体脂过高等因素外[5],还蕴含着复杂多变的分子机制、肿瘤微环境等因素。

  2.1.1.1分子机制对结直肠癌的影响

  通过研究发现,目前主流的分子机制导致结直肠癌发生的有三种途径。

  第一种途径是染色体不稳定性,约占85%的结直肠癌中有染色体不稳定性[38]。虽然通过流式细胞仪、基因组杂交等技术可以很容易的发现染色体不稳定性的存在,但由于其复杂的发生机制,目前为止我们仍然不知道为什么在结直肠癌中会产生染色体不稳定性的基因组[39]。

  第二种途径为微卫星不稳定性,有研究表明,微卫星不稳定性和染色体不稳定性呈相互抵制的状态。一般患有Lynch综合征的患者,其发展到后期绝大多数患者会呈现微卫星不稳定性型的结直肠癌[40]。

  第三种途径为CpG岛甲基化表型,此表型是近几年提出来的新现象,CpG岛甲基化表型是一种基因组中存在的高比例基因启动子区DNA高甲基化的结直肠癌。然而发现CpG岛甲基化表型的发生与微卫星不稳定性出现重合的现象,这也使许多研究碰到了新的难题,但这不妨碍CpG岛甲基化表型的结直肠癌是最为可能成为靶向治疗表型的一种[41]。

  2.1.1.2肿瘤微环境对结直肠癌的影响

  目前对于研究结直肠癌肿瘤微环境可分为三种热门论点,炎症微环境、肠道菌群微环境和缺氧微环境[42]。

  炎症微环境是其中最热点话题,炎症的发生于结直肠癌密切相关,比如溃疡性结肠炎和克罗恩病,这一直是研究结直肠癌发生发展途径中最为重要的一个个步骤。而慢性炎症中通常以单核巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞等免疫细胞的反复浸润为基础,慢慢侵蚀破坏正常组织从而达到发展成结直肠癌的目的[43]。目前有许多研究已经表明有些炎性细胞因子影响着结直肠癌的发生与发展,比如白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)可以通过调节其信号通路从而直接影响结直肠肿瘤的发生与发展。通过我们的前序实验也发现了IL-38也同样参与着结直肠的发生与发展,并且IL-38的表达水平还影响着晚期结直肠癌患者的生存率[36]。

  另一方面肠道菌群微环境也同样影响乳腺癌的发生发展,近些年随着分子生物学的飞速发展,人们对肠道菌群的探究也有着突破性的进展,并且认为对许多肿瘤的发生发展都起到了重要的作用[44]。肠道中的菌群微环境中存在着上百万亿的细菌,从而构建了一个复杂且庞大的微环境,并且试图操控着人们免疫和新陈代谢从而影响着人们的健康[45]。比如有YU等人研究表明,具核梭杆菌可以提高结直肠癌细胞对化疗药物的耐药性,其原因可能是结直肠癌细胞通常激活自噬细胞从而实现免疫逃逸。目前的研究我们有能力控制免疫逃逸的缺口并操控免疫逃逸的“开关”,但由于具核梭杆菌的出现抑制了化疗药物对结直肠癌细胞免疫逃逸的限制,因此出现耐药的情况[46]。

  缺氧微环境同样是重要的微环境之一,肠道组织的缺氧会影响固有免疫系统、血管的生成和肿瘤的代谢,然而肿瘤在缺氧的微环境下通常会发生转移,这也是缺氧微环境极为重要的原因之一[42]。许多研究表明,在缺氧的环境与结直肠癌的发生发展等相关信号通路都密切相关[47]。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)是缺氧微环境中重要的参与者并在其中发挥着重要的作用[48],然而不仅结直肠癌组织中存在HIF-1α,在炎症性肠病的组织中同样存在大量的HIF-1α,这导致加快在缺氧微环境中结直肠肿瘤的生长速度。

  2.1.2乳腺癌的病因与机制

  在肿瘤学中我们得知,身体的正常组织具有有限的生长促进和调节,这有助于保持组织的结构和功能。然而,癌细胞具有延长和慢性增殖的特点[18]。乳房是一个复杂的小管肺泡器官,固定在一个不对称的结缔组织内[19],经历一系列从育龄到衰老的变化。典型的乳房结构包含一层复层上皮,由基底膜为边界,固定在血管、淋巴和间质细胞的模板中[20]。乳腺癌是一种在乳腺细胞中起始的恶性疾病。像其他恶性肿瘤一样,其病因复杂多样,有多种危险因素会增加患乳腺癌的可能性。除了由于环境因素的影响外,还包括着基因突变和致癌通路的活化。

  2.1.2.1基因突变对乳腺癌的影响

  首先是BRCA基因的突变,众所周知,BRCA是抑制癌症细胞的抑癌基因并与单侧乳腺癌密切相关,与DNA的转录调控凋亡、修复损伤都有着很大关系。BRCA基因突变型的乳腺癌可让乳腺癌的发病率比以往增加10倍以上[45]。并且在中国携带BRCA1/2突变的患者远远高出西方国家[44],这是值得我们关注的地方。BRCA1/2导致乳腺癌发生的原因是绝大多数拥有乳腺癌家族史的患者当中,BRCA1/2基因突变呈现的点突变或散布在编码序列和剪接位点连接上的小的插入和缺失,这不仅导致BRCA1蛋白的缩短而且还可导致其生理功能的受损,而这对乳腺癌中肿瘤的形成创造了条件[42]。

  其次是TP53的突变,TP53基因的突变虽然没有BRCA的数量那么庞大但同样占据着患乳腺癌患者人数的很大一部分。而TP53基因的突变常常在HER2阳性患者中出现[49]。TP53基因和BRCA基因同为重要抑癌基因,所有TP53基因一旦突变这将导致其抑制肿瘤细胞能力的丧失。

  PI3K基因的突变常见于HER2阴性患者中[50],当其突变时会导致正常乳腺细胞的去分化并且增强发展成为癌细胞的潜力。不仅PI3K的突变会带来发展成为乳腺癌的可能,PIK3CA的突变还会通向伴随着PTEN蛋白的缺失,从而导致乳腺癌的加速形成并且促进肿瘤的侵袭和转移[51]。

  GATA3基因参与上皮细胞的分化和生长并维持其状态,是非常重要的转录因子。其靶基因涉及多个方便,比如血管的生成、细胞的凋亡与粘附等14。GATA3的突变导致加速乳腺癌的形成其最重要的原因是,当GATA3的突变会明显上调某些促癌基因比如DACH1和GREB1等[52]。

  2.1.2.2致癌通路的活化对乳腺癌的影响

  我们已知有多条信号通路调节着正常乳腺干细胞的发育,干细胞相关基因表达的增高、基因突变、错配修复能力下的降等问题都会影响致癌通路的活化,并直接影响着乳腺癌癌细胞的增值、肿瘤的生长侵袭和转移。NF-κB受体激活剂、RANK配体系统、HER通路活化等均为经典的致癌通路[53]。一旦致癌通路的激活,并且相应癌基因和抑癌基因的突变,促癌基因的上调,这不仅使患者乳腺癌肿瘤的加速发展,而且可能直接影响治疗手段的复杂性与局限性,并明显影响着患者的生存与预后[54]。

  2.2 IL-36、IL-37和IL-38的概述

  IL-36、IL-37和IL-38均属与IL-1家族,是近些年发现的新颖细胞因子,并参与着复杂的免疫功能。IL-36细胞因子包括四个成员,其中IL-36α、IL-36β、IL-36γ和IL-36Ra,IL-36Ra是一种抑制IL-36活化的细胞因子受体信号[55]。IL-36细胞因子与IL-36R和IL-1受体辅助蛋白作为共受体。最近研究显示,IL-36细胞因子和其受体在人体某些器官中明显表达,特别是在肺、皮肤和结肠中[36]。IL-36同样与其他细胞因子一样是炎性细胞因子并且是炎性反应的重要激活剂,不仅刺激先天免疫反应也同样适应先天的免疫反应[56]。

  IL-37与IL-33和IL-1α的功能类似,均为双功能的细胞因子,其表现出不仅可以作为核转录因子发挥作用,也可以通过与细胞表面受体结合激活信号通路[31]。有报道证明IL-37b通过结合白细胞介素18结合蛋白(IL-18 binding protein,IL-18BP)成为一种抑制剂,之后还有人证实到IL-37参与炎症性关节炎的发生与发展[33]。

  IL-38是最新发现的抑炎细胞因子。IL-38与IL-1Ra和IL-36Ra具有相同的结构,所以猜测IL-38可作为IL-1家族的拮抗剂。但根据近些年的研究显示,IL-38的第一个生物学功能是阻断IL-36R的活性,就像IL-36Ra[30]。但IL-38除了其功能类似IL-36Ra之外,有研究表明IL-38可以与IL-1R1结合。IL-38的功能也如同其他家族成员类似,也通过蛋白水解酶进行裂解,尽管现在还没得到其裂解位点的共识。IL-38在多个脏器中表达如扁桃体、胎盘、心脏和脑等,并与心血管疾病和自身免疫性疾病等多种疾病有关。通过我们的前序实验已经发现IL-38与结直肠也同样息息相关,并可以指导患者的预后生存时间[36]。

  2.2.1 IL-36、IL-37和IL-38的受体及信号通路

  IL-36α、IL-36β和IL-36γ的激动性使其连接上IL-36R,导致IL-1中常见的辅助蛋白IL-1RAcP发生募集,从而激活与IL-1α和IL-1β类似的信号通路[57]。有相关报道说明,IL-36γ通过依赖IL-36R去激活JurKat细胞中的NF-κB[58],并且IL-36α、IL-36β和IL-36γ可与IL-1Rrp2结合并且利用IL-1RAcP作为公用的受体[59]。大多数参与IL-36诱导的信号传导分子,如MMPs、抗菌肽、细胞因子、趋化因子和粘附分子,都是炎症性疾病中的重要介质[59]。IL-36细胞因子通过其在炎症性Th1细胞分化中的作用,对人机体内免疫应答中的树突细胞和T细胞均具有显著的作用[60]。

  IL-37与IL-38有一种类似的特征剂量反应曲线[30],IL-37与IL-18R的结合产生SIGIRR(Single Ig IL-1-related receptor),这是一种独特的现象,即低浓度的IL-37具有拮抗作用,而增加浓度并不能影响脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的TNF,IL-37甚至可以增加产生高浓度的TNF[61]。有趣的是,低浓度的IL-38在阻断念珠菌诱导的IL-17反应方面更有效(1-10 ng/毫升范围);更高浓度的IL-38诱导更多的IL-17产生,这种模式非常类似于IL-37[30]。因此,一种可能性是IL-38在与IL-36R结合后招募SIGIRR作为共同受体,IL-36R反过来将负责这种独特的剂量反应效应[28]。转录1-4磷酸化的信号转导和激活因子,与多种促炎细胞因子信号传导有关。炎症信号级联中,p38有丝分裂在激活蛋白激酶磷酸化中,起到了很重要的作用。IL-37抑制激酶的磷酸化,促进糖原合成酶激酶-3α/β的磷酸化,从而使激酶失活,提示IL-37的直接抗炎机制[62]。有人在小鼠RAW264.7巨噬细胞稳定转染的研究中表明,这些细胞缺乏IL-37蛋白表达。此外,IL-37mrna在转染细胞中通过IL-37转录稳定的3-UTR快速降解。脂多糖刺激后,人单核细胞IL-37mrna和蛋白水平均升高,说明LPS能稳定IL-37mrna。全长IL-37cdna下游第5外显子缺失可显著增加IL-37mrna的表达,说明IL-37mrna是编码区功能不稳定的决定性的因子[63]

  IL-38与IL-36Ra的作用相似,通过结合IL-36R引发其拮抗作用[30]。IL-36Ra阻断第二受体IL-1RAcP的募集,IL-1Rc与IL-1Ra一样阻断IL的信号传导。IL-36Ra阻断了第二受体IL-1racp的募集,而第二受体IL-1racp和IL-1ra一样,也阻断了IL-36R的信号传导[64]。然而,IL-38是否具有类似的拮抗作用仍有待证实,包括阻断IL-1RAP的募集。已有多项研究证实:IL-1家族成员在炎性细胞中广泛表达。这些细胞因子与细胞表面受体IL-1R结合并诱导下游信号传导,包括下游核转录物,如NF-κB和激活蛋白-1。此外,作为反馈和调节机制,这些信号分子诱导环氧合酶,一氧化氮合酶和其他炎症介质的表达,以促进炎症的发展[65,66]。根据IL-38的特征和IL-38与IL-36Ra的同源性,可以得出结论,IL-38作为IL-36Ra,在炎性疾病的发生发展中起到抗炎作用。IL-36、IL-37和IL-38的受体及信号转导通路如图2.1中所示。

  图2.1 IL-36、IL-37和IL-38的受体及信号转导通路

  2.2.2 IL-36、IL-37和IL-38与肿瘤的关系

  根据有关研究发现,IL-36α、IL-36β和IL-36γ均存在抑制肿瘤的能力,而在我们前体实验中也可以发现IL-36的表达与结直肠癌癌组织有密切的关系,IL-36α的高表达存在于在结直肠癌患者的肿瘤中,而且IL-36α的低表达与结直肠癌患者的肿瘤大小和TNM分期也密切相关,但IL-36β与结直肠癌的相关性并不明显,但其在结直肠癌肿瘤中的表达却是三者中敏感性于特异性最出色的[35]。有趣的是,IL-36γ特殊的抗肿瘤机制不同于IL-36α和IL-36β。有研究表明IL-36γ可以增强CD8+T细胞、NK细胞和γδT细胞的功能从而达到将肿瘤微环境变换成一种易于破坏肿瘤细胞的环境,以此为基础实现强大的抑制肿瘤的能力。

  由于IL-37具有抑制炎症因子产生的能力,因此许多研究团队都证实IL-37在癌症中的作用大部分都显示其在癌症中的水平降低,且低水平与预后不良相关[56,67-69]。此外,研究已经确定IL-37可以抑制多种癌症类型的肿瘤进展、转移、侵袭和转移,包括纤维肉瘤[70]、肝细胞癌[71]、宫颈癌[72]、肺癌[73]和结肠癌[74]。与这些研究一致,肿瘤内注射IL-37或肿瘤细胞过度表达IL-37都会抑制肿瘤生长[67,69,70]。

  非小细胞肺癌中IL-38的表达,相对于邻近的非肿瘤组织程下降的趋势,而IL-38的表达缺乏的指征预示着不良的预后和生存率[75]。重组IL-38抑制β-catenin的表达,减少肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,同时增加细胞死亡。与IL-38在抑制肺癌中的作用一致,IL-38在体内的过度表达抑制了NSCLC的发展,增加了对化疗药物的敏感性[55]。我们团队在过去两年中的研究表示,IL-38在结直肠中有着明显抑制癌症的表现。在非癌组织中,IL-38的表现要明显高于癌组织,并同样预示着IL-38低表达会带来不良的预后和生存率[36]。

  2.3结语和展望

  新型细胞因子的出现是在肿瘤发生发展中起到良好的抑制作用还是促进肿瘤的形成?是单方面抑制的机制还是具有双面性?在某些特定的肿瘤中是发挥着怎样的作用?这些问题都将是我们未来努力探索的方向和动力。而就临床而言,IL-36、IL-37和IL-38在肿瘤中的复杂机制一直是大家讨论的热点,如果我们能攻克并且掌握其在肿瘤中具体的作用,这将会为临床对结直肠癌、乳腺癌以至于所有相关肿瘤的发生反展提供良好的基础和方向。

  第3章正文

  3.1实验材料

  3.1.1实验对象

  (1)IL-38 KO小鼠12只、WT小鼠12只

  IL-38基因敲除小鼠的饲养、结直肠癌模型的诱导建模和取材工作。

  (2)乳腺癌患者临床病理资料的收集

  1)所有乳腺癌患者病理资料和蜡块组织均由上海交通大学医学院附属同仁医院病理科提供。

  2)所有乳腺癌患者均来自上海交通大学医学院附属同仁医院,在2014年至2018年确诊为乳腺癌,并在医院接受外科手术治疗。

  (3)实验组和对照组

  在上海交通大学医学院附属同仁医院共收集249例乳腺癌患者资料,IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37和IL-38分别匹配到的总患者人数为184、121、164、134和128例。其中将乳腺癌癌组织作为实验组,乳腺根治术所切下的正常乳腺组织和癌组织旁切缘部分称为非癌组织,并作为对照组,分别为91、18、54、27和34例。

  (4)乳腺癌患者随访资料的收集

  249例乳腺癌患者所有的随访资料均由上海市长宁区疾病控制中心所提供。在249例乳腺癌患者中随访到60名具有完整资料的患者。截止到2019年4月,54例患者生存,6名患者死亡。

  3.1.2实验所用试剂、方法、仪器

  3.1.2.1实验所用试剂和方法

  (1)组织芯片所用蜡块:型号UB06-1,上海宇北医疗器械有限公司。

  (2)IL-36α:兔抗人多克隆抗体,浓度1:1600,(Ab180909,Abcam,Cambridge,UK)

  (3)IL-36β:兔抗人多克隆抗体,浓度1:6000,(Ab180890,Abcam,Cambridge,UK)

  (4)IL-36γ:小鼠抗人单克隆抗体,浓度1:1000,(Ab156783,Abcam,Cambridge,UK)

  (5)IL-37:兔抗人多克隆抗体,浓度1:600,(Ab153889,Abcam,Cambridge,UK)

  (6)IL-38:兔抗人多克隆抗体,浓度1:2400,(Ab180898,Abcam,Cambridge,UK)

  (7)HRP偶联二抗:1:1稀释,兔鼠通用二抗聚合物,北京红杉金桥生物技术公司。

  (8)血清:兔血清,浓度1:1000,博士德生物工程有限公司。

  (9)DAB显色液:采用DAKO公司产品。

  (10)苏木素:采用珠海贝索生物科技有限公司的苏木素。

  (11)EDTA修复液:采用DAKO公司产品。

  (12)PBS(PhosphateBuffered Saline,磷酸盐缓冲体系)配置方法:

  1)氯化钠(NaCl),8.0g

  2)氯化钾(KCl),0.2g

  3)磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O),3.5g

  4)磷酸二氢钾(KH2PO4),0.2g

  5)定容至1L,调pH值至7.4

  3.1.2.2实验所用仪器

  (1)Olympus BX63光学显微镜:由上海交通大学医学院附属同仁医院提供,60倍空气镜为Olympus BX63光学显微镜配套产品。

  (2)磁力搅拌器,型号为MS-500,为INTLLAB公司产品。

  3.2实验方法

  3.2.1 AOM/DSS诱导构建IL-38 KO小鼠结直肠癌模型

  (1)小鼠适应三天

  (2)所有小鼠按12.5mg/kg的剂量腹腔注射给予AOM诱导结肠癌。

  (3)正常水喂养使小鼠恢复5天。

  (4)给予2.5%DSS应用水5天(给药第三天换新的DSS液)。

  (5)正常水喂养使小鼠恢复2周。

  (6)再次给予2.5%DSS应用水5天(给药第三天换新的DSS液)。

  (7)正常水喂养使小鼠恢复2周。

  (8)给予2.0%DSS应用水5天(给药第三天换新的DSS液)。

  (9)后续正常饲养观察30-100天(预计15周),如图3.1所示。

  图3.1小鼠诱导时间表

  (10)构建模型成功后取材。

  正常饲养30天后,取1只小鼠吸入乙醇后脱髓处死,检测结直肠肿瘤形成情况,如果肿瘤不明显,继续饲养。一般90天左右易感小鼠出现脱肛,肿瘤比较明显,野生小鼠也会出现肿瘤,但体积较小数量较少。

  3.2.2乳腺癌患者组织芯片的制作

  (1)收集2014年至2018年乳腺癌患者的组织蜡块。

  (2)根据对应乳腺癌患者切片上圈出的具有代表性的癌组织区域和乳腺正常组织或癌旁的切缘部分的非癌组织。

  (3)在对应的乳腺癌患者病理蜡块上找到患者切片上具有代表性的区域,以2mm为直径取出对应区域。

  (4)取出的具有代表性区域的组织置于制作组织芯片的蜡块中,每例患者取出5块相应的组织,其中1、2、3处为患者不同区域的癌组织;第4处为患者乳腺正常组织或者癌组织旁的切缘的正常组织;第5处则为患者淋巴结转移的癌组织。组织芯片1行一共10个孔可放入两例患者的组织,共7行。如图3.2所示

  图3.2组织芯片蜡块(左)、组织芯片免疫组织化学染色切片(中)和组织芯片HE染色切片(右)

  (5)将组织芯片置于80度烤箱10分钟,以厚度为4μm进行切片。

  (6)将制作完成的组织芯片白片进行HE染色。

  3.2.3免疫组织化学染色

  (1)切片;将制作好的组织芯片蜡块以4μm的厚度切片。

  (2)烤片:置于80℃的烘箱中烘烤30分钟。

  (3)脱蜡:将白片置于二甲苯中三次,之后放入不同的酒精浓度梯度(100%、95%、80%),最后用水冲洗。

  (4)修复:将白片放入全自动修复仪中98℃修复30分钟。

  (5)阻断:在白片上加入过氧化酶阻断剂,之后在磁力搅拌器中放入没过白片的reaction buffer溶液洗三次每次30分钟。

  (6)加一抗:分别在每张白片上加上IL-37和IL-38抗体,室温等待1小时,之后在磁力搅拌器中放入没过白片的reaction buffer溶液洗三次每次30分钟。

  (7)加二抗:分别在每张加入一抗的白片上加入兔鼠通用二抗聚合物(一比一稀释),室温30分钟,之后在磁力搅拌器中加入没过白片的reaction buffer溶液洗三次每次30分钟。

  (8)显色:每张白片加入200μl的DAB溶液显色,室温5分钟之后流水冲洗。

  (9)复染:将所有染过的片子置于苏木素中15秒,然后流水冲洗,再放入盐酸酒精分化1秒,再用流水冲洗之后置于不同酒精浓度梯度中(75%、95%、100%),最后置于二甲苯中3次。

  (10)封片

  3.2.4拍照

  制作好并染色完成的组织芯片切片置于Olympus BX63光学显微镜下进行拍照,60倍空气镜为显微镜配套产品。组织芯片切片上的每一块组织均按顺序拍摄30-50张照片。

  为了降低误差提高准确性,我们在拍照的同时注意一下事项:

  1)保证拍照时屋内光线始终保持一致;

  2)不更换物镜,全程使用60倍空气镜进行拍摄;

  3)白平衡始终保持相同数值。

  3.2.5 Image-Pro Plus 9.1图像分析软件

  (1)将拍摄好的照片放入Image-Pro Plus 9.1图像分析软件中。

  (2)选取阳性阴性具有代表性的样张。

  (3)在样片上选取免疫组织化学阳性的区域作为AOI,同样标记免疫组织化学染色阴性的区域。

  (4)使用软件统计并计算有效区域的的面积和光密度平均值。

  (5)分析所拍摄素有照片。

  (6)分析得出的所有乳腺癌癌组织的数值,以每个人的序号为单位,计算出每个人癌组织和非癌组织IL-37和IL-38的表达量,最后求得平均数用于之后的统计分析。

  3.2.6运用的统计学方法

  (1)用t检验判断IL-38 KO小鼠与WT小鼠在共同诱导构建结直肠癌模型期间体重之间的差异。

  (2)用t检验判断IL-38 KO小鼠与WT小鼠之间粪血分数、结直肠长度、结直肠重量、肿瘤数量、肿瘤大小、脾脏重量和肝脏重量之间的差异。

  (3)每位患者的总生存期,以患者入院手术完成的日期为开始,到患者死亡或者终止随访日期为结束。

  (4)IL-36、IL-37和IL-38的表达量的高低由得出相应数值的中位数为界限判断。

  (5)用Mann Whitney检验法判断乳腺癌癌组织与非癌组织之间表达量差异。

  (6)使用one-way ANOVA检验法和Brown-Forsythe and Welch ANOVA检验法判断多组数据之间表达量的差异。

  (7)用GraphPad Prism 8制作ROC曲线分析IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌癌组织与非癌组织中表达量的敏感性与特异性。

  (8)用乳腺癌患者的随访资料和GraphPad prism 8制作生存曲线,用log-rank检验法分析IL-36、IL-37和IL-38在癌组织和非癌组织中表达量与乳腺癌患者生存时间之间的关系。

  (9)P值小于0.05为具有统计学意义。

  3.3实验结果

  3.3.1第一部分:IL-38与结直肠癌

  3.3.1.1 IL38基因敲除小鼠诱导结直肠癌模型实验

  3.3.1.1.1在AOM/DSS模型中,IL-38 KO小鼠体重的变化与粪血评分的分析

  根据我们前期体内试验的基础,我们进一步将IL-38推进到体外动物试验去探究其在肿瘤内的作用。我们在这项试验中应用IL1f10 KO(IL-38 KO)小鼠和野生型(WT)小鼠进行AOM/DSS诱导结直肠癌模型构建,大部分IL-38 KO小鼠和野生型WT小鼠均出现与结直肠癌相关的腹泻、血便和脱肛等症状。IL-38 KO小鼠与WT小鼠在接受第一次2.5%DSS诱导的后,第一天IL-38 KO小鼠的体重就出现了减轻的现象,在第三天中IL-38 KO小鼠的体重明显低于WT小鼠并伴随着更早更严重的疾病临床体征(分别为基础体重的85.3±1.0%和90.8±1.0%,P=0.003,图3.3A)。在第一次DSS诱导期间进行便隐血实验的测验,IL-38 KO小鼠的粪便含血量和粘稠度都高于WT小鼠,但不具备统计学意义(P>0.05,图3.3B)。结束第一次DSS诱导后,IL-38 KO小鼠和WT小鼠的体重均呈现增长的趋势,并且在第十二、十五和十九天中,IL-38 KO小鼠的体重仍然明显低于WT小鼠并都呈现出统计学意义(P=0.01、P=0.005、P=0.008,图3.4A)。在第二次DSS诱导后IL-38 KO小鼠和WT小鼠体重均迅速降低且具有统计学意义,但同样测得的便隐血实验不存在统计学意义,但我们可以看出IL-38 KO小鼠的整体便隐血分数要高于WT小鼠(分别P=0.003,P>0.05,图3.3AC)。第二次DSS诱导之后小鼠体重均呈现增长的趋势,直到第三次DSS诱导导致IL-38 KO小鼠和WT小鼠的体重出现下降,但最后一次便隐血试验统计依然不具备统计学意义(分别P=0.01,P>0.05,图3.3AD)。结束DSS诱导后,小鼠体重逐渐增长,WT小鼠体重增长的速度明显大于IL-38 KO小鼠(P=0.03,图3.3A)。正常饲养第八十二天,大部分IL-38 KO小鼠的已经出现严重的脱肛、血便腹泻等疾病的临床表现(P=0.04,图3.3A)。

  图3.3 IL-38 KO小鼠和WT小鼠体重与基础体重相比的百分比变化图和粪血分数图

  3.3.1.1.2在AOM/DSS模型中,IL-38 KO小鼠对抵抗结直肠癌发生的能力降低

  在此项研究中,经DSS诱导后的IL-38 KO小鼠和WT小鼠均出现了与结肠癌相关的经典病理变化。IL-38 KO小鼠结直肠肠壁上的肿瘤的数量要明显高于WT小鼠肠壁上肿瘤的数量,并具有明显的统计学意义,根据散点图我们能看出来IL-38 KO小鼠的肿瘤数量集中在7-11个之间,而WT小鼠结直肠内的肿瘤个数则集中在1-2个之间(P=0.0004,图3.4abf)。不仅如此,IL-38 KO小鼠肠壁上的肿瘤大小也同样比WT小鼠有着明显的增大,并具有显著的统计学意义(P<0.0001,图3.4ae)。在结直肠图片中我们也可以很清晰的看出,IL-38 KO小鼠的结直肠有着明显的增厚和缩短并且透光度下降、重量增加,而WT小鼠的结直肠依然保持着相对正常的长度、形态和重量,结直肠重量和结直肠长度都具有统计学意义(分别P=0.003,P=0.02,图3.4acd)。通常经过DSS诱导小鼠的脾脏重量会显著增加,根据柱状图显示IL-38 KO小鼠的脾脏重量要高于WT小鼠,但不具有统计学意义(P>0.05,图3.4h),肝脏重量同样不具有统计学意义(P>0.05,图3.4g)。根据肿瘤生长情况说明小鼠在敲除掉IL-38之后对结直肠肿瘤发生的抵抗力有着明显的下降。

  图3.4取材后小鼠器官与肿瘤的散点图和柱状图

  3.3.2第二部分:IL-36、IL-37和IL-38与乳腺癌

  3.3.2.1乳腺癌患者信息统计

  表3.1列出了原发性乳腺癌患者的人口统计学信息。在上海交通大学医学院附属同仁医院共收集249例乳腺癌患者资料,IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37和IL-38分别匹配到的总人数为184、121、164、134和128例。其中将乳腺癌癌组织作为实验组,乳腺根治术切下来的正常乳房组织和癌组织旁切缘部分称为非癌组织并作为对照组,分别为91、18、54、27和34例。由于一些早期数据的缺失和不完整,有些比较数据与患者统计的总数不相同,比如IL-38标记下的淋巴结转移,转移人数为102,非转移人数为23。通过大量文献的预览,我们通常把乳腺癌患者年龄分为5个阶段[34],小于40岁、40至49岁、50至59岁、60至69岁和大于等于70岁,IL-36α对应的人数分别为20、34、29、42和56例;IL-36β对应的人数分别为15、23、18、27和33例;IL-36γ对应的人数分别为20、33、27、32和46例;IL-37则对应19、25、22、28和34例;IL-38对应的年龄分组人数分别为15、20、24、31和36例。我国女性平均绝经年龄为49.5岁[76],我们将其分为绝经前和绝经后,IL-36α标记下绝经前和绝经后患者人数为54和127例;IL-36β则对应38和78例;IL-36γ则对应53和105例;IL-37则对应44和84例;IL-38则对应35和91例。我们根据大量参考文献,通常可将肿瘤大小分为四个等级[34],肿瘤直径0-20mm为T1,21-50mm为T2,大于50mm为T3,侵袭皮肤的肿瘤为T4,IL-36α标记下记录的人数分别为31、39、4、6例;IL-36β标记下的人数分别为52、48、8、9例;IL-36γ标记下分别为69、64、10、8例;IL-37标记下分别为55、52、6、9例;IL-38标记下分别为56、52、8、7例。根据最新WHO乳腺癌的组织学分类作为参考,可以将我们的数据分为四大类:浸润性导管癌、浸润性小叶癌、大汗腺癌和粘液癌,而在表3.1中可见,浸润性导管癌包括了我们实验数据98%以上,所以作为我们研究的重点组织学分型,IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37和IL-38共分别匹配到173、112、151、125和122例。我们将浸润性导管癌分为高分化、中分化、低分化三个等级,IL-36α标记下高、中、低分化程度分别对应18、86、54例;IL-36β标记下分化程度分别为6、49、48例;IL-36γ标记下分化程度分别为6、67、67例;IL-37标记下分化程度分别为6、45、63例;而IL-38标记下分别为5、52、57例。以上数据均有表3.1显示。

  表3.1乳腺癌患者信息统计表

  3.3.2.2 IL-37、IL-38在乳腺癌患者癌组织和非癌组织中表达量的差异分析

  图3.5分别描述了IL-37和IL-38在乳腺癌患者癌组织与非癌组织之间的表达情况。分别包括IL-37在癌与非癌之间的表达(图3.5A)、IL-38在癌与非癌之间的表达(图3.5C)、IL-37在肿瘤分化程度中的表达情况(图3.5B)、IL-38在肿瘤分化程度中的表现(图3.5D)的柱状图。柱状图中Y轴表示IPP 9.1软件所分析等到的图像单位。还包括IL-37和IL-38标记组织后免疫组化染色的病理切片对比图片(图3.5I-X)。

  在乳腺中肿瘤相邻位置的正常乳腺腺体组织处检测到IL-37和IL-38的存在,主要位于正常乳腺腺体细胞细胞浆内(图3.5I)。然而在乳腺肿瘤组织中IL-37和IL-38的染色要比正常乳腺组织淡很多(图3.5I、图3.5III)。根据IL-37和IL-38在乳腺组织中的定量分析(表3.2),癌组织与非癌组织之间的对比可见,在非癌组织中IL-37和IL-38的表达量都要高于其在癌组织中的表达量,分别比癌组织中表达量高90%和50%(全部P<0.0001,图3.5AC)。并且在乳腺癌分化程度中IL-37和IL-38的表达量呈现着相同的趋势,IL-37在高分化乳腺癌中的表达量要比在低分化中表达量高72%,而其中分化中的表达量也比在低分化中表达量高40%(分别P=0.005、P=0.005,图3.5B),IL-38在中分化中的表达量要远高于在低分化中表达量的40%(P=0.007,图3.5D)。但在乳腺癌的淋巴结转移、年龄、绝经期以及肿瘤位置中,IL-37和IL-38的表达量均无明显的差异(表3.2)。

  图3.5乳腺癌癌组织和非癌组织中IL-37、IL-38的表达量与病理特征之间表达差异的图组

  表3.2乳腺癌患者癌组织和非癌组织中的IL-37、IL-38表达量与病理特征之间的表达差异

  3.3.2.3 IL-36在癌组织和非癌组织中表达量的差异分析

  图3.6为IL-36α、IL-36β和IL-36γ在乳腺癌患者非癌组织和癌组织之间的表达差异,见图3.6A、3.6B和3.6C中所示。其中,柱状图中的Y轴表示IPP 9.1软件所判定的染色浓度单位。IL-36α、IL-36β和IL-36γ在非癌组织中(图3.6a,3.6c和3.6e)与癌组织中(图3.6b,3.6d和3.6f)表达量的代表性免疫组化染色图像如图3.6中所示。

  从图3.6中可观察到:与非癌组织相比,乳腺癌癌组织中IL-36α和IL-36β的表达量分别减少了40%和40%,而在IL-36γ在非癌组织中的表达量减少35%,并均具有统计学意义(分别P<0.0001、P=0.03、P=0.03,图3.6ABC)。在乳腺癌癌组织中的IL-36α,IL-36β表达相对较弱,并在分化较差癌细胞的细胞质与细胞核中呈扩散式分布,如图3.6b和3.6d中所示。而在乳腺癌非癌组织中IL-36γ的表达相对较弱,如图3.6e中所示。

  图3.6 IL-36α、IL-36β和IL-36γ在非癌组织与癌组织之间表达差异的图组

  3.3.2.4乳腺癌患者中IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌癌组织与非癌组织中的表达量与ROC曲线之间的关系

  我们利用ROC曲线来检测IL-36、IL-37、IL-38的在乳腺癌癌组织与非癌组织中表达的特异性和敏感性。IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37和IL-38在癌组织和非癌组织中的特异性敏感性,ROC曲线下面积分别为0.6643、0.7593、0.5563、0.9584和0.7681(图3.7abced)。而在IL-36组别中,虽然3个标记物的敏感性和特异性不如IL-37和IL-38,但根据图3.7可知,IL-36β在癌组织和非癌组织内表现出较高的敏感性与特异性,且高于IL-36α和IL-36γ。

  图3.7 IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌癌组织和非癌组织中表达量的ROC曲线

  3.3.2.5乳腺癌癌组织中IL-36、IL-37和IL-38的表达量与患者生存时间的生存曲线分析

  所有乳腺癌患者的随访资料均来自于上海市长宁区疾病控制中心,具体情况如下:在收集到的249例乳腺癌患者中,共获得60名患者随访信息,由于组织芯片点位少量丢失的问题,每个标记下共匹配到的患者随访数量均不同。截止至2019年4月,IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37和IL-38分别匹配到的乳腺癌患者随访人数为:38、25、26、26和28位,在这些乳腺癌患者中,最长生存时间期为43个月。

  3.3.2.5.1乳腺癌癌组织中IL-37和IL-38的表达量与患者生存时间的生存曲线分析

  根据随访到的患者资料将IL-37和IL-38的表达量分别匹配到各个患者,IL-37共匹配到26例患者其中4例死亡,IL-38则匹配到28例患者其中4例死亡。根据两个标记在不同患者中产生的表达量的不同,我们根据中位数将两个标记分别分成高分化组和低分化组,然后通过Log-rank(Mantel-Cox)检验法分析IL-37和IL-38在癌组织和非癌组织中表达量与乳腺癌患者生存时间之间的关系。

  通过数据表明,IL-37低表达组比IL-37高表达组的生存率和生存时间高(p=0.04,图3.8A),提示肿瘤中IL-37低表达的患者的生存率和生存时间要高于肿瘤中高表达的患者。

  我们根据病人临床病理的数据并且通过IL-37和IL-38的表达量对患者的生存曲线进行了详细的分层式分析。在乳腺癌患者的肿瘤低分化中,IL-37低表达组比IL-37高表达组呈现了较高的生存率和生存时间(p=0.03,图3.8B)。在her-2阴性的患者中,IL-37低表达组和高表达组患者生存曲线表现出了明显的差异(p=0.02,图3.8C),低表达组的生存期及生存率要明显高于高表达组。绝经后的患者(p=0.03,图3.8D)和肿瘤大小T1-3患者(p=0.04,图3.8E)则和其他结果和情况均相同,低表达组的生存率和生存期要明显高于高表达组。尽管无淋巴结转移的乳腺癌患者的生存曲线没有统计学意义,但通过趋势我们能明显观察到IL-37低表达组比高表达组表现出更高的生存率和生存期(p=0.07,图3.8F)。在所有情况下,IL-37低表达的患者均表现出了较高的生存率和生存时间。

  图3.8 IL-37在乳腺癌癌组织中的表达量与患者生存时间的生存曲线

  在IL-38和患者生存关系中,虽然P值大于0.05但我们能从图中明显的看出来,高表达组要比低表达组具有更高的生存期和生存率(P=0.3,图3.9)。

  图3.9 IL-38在乳腺癌癌组织中的表达量与患者生存时间的生存曲线

  3.3.2.5.2乳腺癌癌组织中IL-36α、Il-36β和IL-36γ的表达量与患者生存时间的生存曲线分析

  根据随访到的患者资料将IL-36α、IL-36β和IL-36γ的表达量分别匹配到各个患者,IL-36α共匹配到38例患者其中5例死亡,IL-36β则匹配到25例患者其中4例死亡,IL-36γ则匹配到26例患者其中5例死亡。

  通过图3.10可知IL-36α和IL-36β均作为抑癌因子在乳腺癌内表现出明显的保护作用,高表达组的生存率和生存期均明显高于低表达组。IL-36α和IL-36β在乳腺癌癌组织中的高表达组均高于其在低表达组中的生存率和生存期(分别P=0.003、P=0.04,图3.10AB)。在肿瘤中-低分化中两者同样表现出高表达组的生存率和生存期要高于低表达组(分别P=0.006、P=0.03,图3.10CD)。在肿瘤大小T1-3的患者中,IL-36α和IL-36β的高表达组的生存率和生存期明显高于低表达组(P=0.004、P=0.02,图3.10EF)。IL-36α、IL-36β绝经后的患者中高表达组也呈现较高的生存率和生存期并具有明显的统计学意义(P=0.003、P=0.04,图3.10GH)。无淋巴结转移也同样呈现相同的趋势(P=0.005、P=0.04,图3.10IJ)。肿瘤在右乳中的患者,IL-36α的高表达组比低表达组呈现明显的高生存率和高生存期(P=0.004,图3.10K),然而IL-36β并没有统计学意义但依然表现出高表达组比低表达组生存率高(P=0.09,图3.10L)

  图3.10 IL-36α和IL-36β在乳腺癌癌组织中的表达量与患者生存时间的生存曲线图组

  IL-36γ特殊的抑制肿瘤机制导致其表现与IL-36α和IL-36β截然不同。从图3.11可知,IL-36γ在肿瘤中的表现出低表达高生存率和高生存期的趋势(P=0.1,图3.11),虽然没有统计学意义的支持,但IL-36γ低表达组比高表达组呈现较高的生存率和生存期却在趋势中清晰的表现出来。

  图3.11 IL-36γ在乳腺癌癌组织中的表达量与患者生存时间的生存曲线

  3.3.2.6乳腺癌癌组织中IL-36、IL-37和IL-38的表达量在患者绝经期前后中的差异分析

  图3.12是乳腺癌患者中IL-36、IL-37和IL-38的表达在患者绝经期前后中差异的柱状图。我们能看出来IL-36、Il-37和IL-38的表达在绝经前和绝经后均没有明显差异。我们猜测IL-36、IL-37和IL-38表达量的高低与患者绝经前后没有直接关系,但其表达量的高低可能指导着乳腺癌患者绝经前后的术后生存时间(图3.8D,图3.10GH)。

  图3.12乳腺癌患者癌组织中IL-36、IL-37和IL-38的表达量在患者绝经期前后中的差异图组

  3.4讨论

  3.4.1第一部分:IL-38与结直肠癌之间的关系

  3.4.1.1 IL-38在结直肠癌中的表达与患者临床病理之间的关系

  根据我们前期试验的基础发现IL-38在结直肠癌中不可忽视的作用:IL-38的表达水平越低,癌组织的分化程度就越差。在单因素与多因素分析中,可得到IL-38的表达量是结直肠癌患者术后生存时间的独立预测因子[36]。结合结直肠癌的分化程度与癌组织中IL-38的表达量进行分析,推测IL-38的表达量可能有利于维持正常结直肠微环境中肠粘膜的稳态[36]。所以通过以上的前期实验得出结论并提供有力的理论基础从而指导这次动物实验。

  3.4.1.2在AOM/DSS模型中,IL-38 KO小鼠体重的变化与粪血评分

  随着世界范围内结直肠癌的发病率迅速的增加,人们已经做出了巨大的努力去了解和克服结直肠癌的发病机理和治疗方法。根据前期体外临床试验的理论基础,在本研究中,我们提供了体内的直接证据,证明IL-38在结肠炎相关的结直肠癌的发展中起抑制作用。

  AOM/DSS诱导的结直肠癌是最成熟也是代表了当下公认的与结肠炎相关的结直肠癌模型。由于体重减轻是疾病进展的指标之一,因此在三个DSS治疗期间均监测了小鼠的体重[77]。我们发现,三次DSS诱导阶段和实验终点,IL-38 KO小鼠组体重的减轻百分比明显高于WT小鼠对照组。此外,IL-38 KO小鼠治疗组在DSS诱导期间的便隐血试验所呈现的粪血分数也明显高于WT小鼠对照组。这些发现表明,IL-38的存在有利于维持正常小鼠结直肠微环境中肠粘膜的稳态[78],并能够维持有助于提高局部宿主的免疫力[27],从而起到减缓结直肠从肠炎发展到结直肠癌的速度。这也与我们在前期临床试验的结论相吻合:IL-38作为一种抑癌因子存在于正常结肠组织中。因此,在DSS诱导期间,IL-38 KO小鼠组的体重相对WT小鼠组的体重呈现降低的趋势,并且出现恶病质。

  3.4.1.3在AOM/DSS模型中,IL-38 KO小鼠对抵抗结直肠癌发生的能力降低

  我们的研究结果表明,我们用DSS诱导IL-38 KO小鼠和WT小鼠诱发结直肠癌,而缺少IL-38表达的基因敲除鼠展现出更加严重的结直肠癌症状(腹泻、便血、脱肛、体重减轻),而WT小鼠却由于IL-38的存在保持着良好的免疫微环境从而延缓结直肠癌的进一步发展。在每一次DSS诱导期间IL-38 KO小鼠组和WT小鼠组均出现相应的体重下降趋势,IL-38 KO小鼠与WT小鼠相比,体重减轻更多,证明IL-38 KO小鼠对DSS的诱导更加敏感和更缺少抵抗力。而在第82天结束诱导时候可以明显发现IL-38 KO小鼠要出现非常典型结直肠癌症状和恶病质。取材后,IL-38 KO小鼠的结直肠长度明显缩短并且重量也随之增加。体重反映了急性和慢性阶段疾病的严重性,而结肠长度更好地反映了慢性结肠炎中疾病的严重性[79]。缺少IL-38对局部宿主的免疫力和对组织的保护能力,IL-38 KO小鼠中缩短的结直肠壁上肿瘤数量明显多于WT小鼠,结直肠壁上肿瘤大小大于WT小鼠,脾肿大程度也同样高于WT小鼠,虽然脾肿大不具备统计学,但可能是由于DSS诱导WT小鼠同样产生相应的肠炎表现,导致脾肿大。而IL-38 KO小鼠与WT小鼠肝重量之间不呈现统计学意义,可能是因为IL-38 KO小鼠的结直肠癌还没有转移到肝脏,所有不具备统计学意义。虽然DSS诱发的结肠癌相关的宏观变化通常包括结肠缩短,结肠重量与长度之比增加和脾肿大[80],但与IL-38 KO小鼠相比WT小鼠在诱导结束后并没有呈现明显的疾病体征,结直肠缩短、结直肠重量增大等现象,也正是因为WT小鼠肠道受IL-38的保护从而减缓了症状的发生。

  3.4.2第二部分:IL-36、IL-37和IL-38和乳腺癌之间的关系

  3.4.2.1 IL-37、IL-38在乳腺癌患者癌组织和非癌组织中表达量的差异

  根据实验数据我们可以得到:IL-37和IL-38的表达量均在乳腺癌患者非癌组织中表达明显,而在癌组织中表达水平明显降低,其中IL-37的表达量在癌组织中降低最为明显,约降低90%。IL-37和IL-38的表达在乳腺癌患者肿瘤分化程度中也体现出了很明显的作用,在肿瘤高分化中IL-37的的表达量要明显高于中分化和低分化65%,而同样IL-38在肿瘤高分化和中分化中的表达量也明显高于低分化患者中的表达量,这结果都说明IL-37和IL-38的蛋白表达量的高低是对乳腺癌肿瘤有着不可忽视影响的。虽然没有研究直接表明IL-37和IL-38在乳腺癌的发生发展中有指导作用,但Baker等人已证实IL-37和IL-38确实在肿瘤发展中起到了保护的机制[55]。我们已经可知IL-37和IL-38是一种抑炎因子在炎症性疾病中发挥着不可或缺的作用,但通过本次实验我们发现IL-37和IL-38在乳腺非癌组织中的表达要远高于癌组织中的表达,这也说明其可能作为一种保护机制在非癌组织中发挥着抑制肿瘤的能力。未来我们也会进一步的去探究IL-37和IL-38在乳腺癌中确切的抗肿瘤机制。

  3.4.2.2 IL-36在乳腺癌癌组织和非癌组织中表达量的差异

  根据本次实验数据我们得到:乳腺癌患者癌组织中IL-36α,IL-36β的表达水平与其在非癌组织中明显降低,均约减少40%。然而由于IL-36γ与IL-36α、IL-36β在肿瘤内抑制肿瘤的方式并不相同。IL-36γ被证明可以增强CD8+T细胞,NK细胞和γδT细胞的功能,将肿瘤微环境转变为一种有利于肿瘤破坏的细胞,并最终具有强大的抗肿瘤作用[26],所以IL-36γ在患者癌组织中的表达要明显高于非癌组织。这也就说明了IL-36α,IL-36β和IL-36γ的蛋白表达量可能对乳腺癌患者有影响。有研究表明,IL-36α,IL-36β和IL-36γ都属于促炎细胞因子[81],或在炎症性肠病中发挥作用[82]。目前的研究对IL-36γ的比较深入,特别是机制方面已有进展,迄今为止,在该家族的其余成员中,IL-36α和IL36β的研究表明,IL-36α也具有抑癌作用。IL-36α被证明可抑制卵巢癌细胞的生长[83]。但是,这种抑制功能的机制尚不清楚。因此,未来将进一步研究IL-36α、IL-36β和IL-36γ在肿瘤发生中的确切机制,特别是在乳腺癌发展中信号传导途径的部分。

  3.4.2.3乳腺癌患者中IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌癌组织与非癌组织中的表达量的ROC曲线

  我们通过制作ROC曲线是为了判断IL-36、IL-37和IL-38作为生物标记物在乳腺癌中是否具有足够的特异性和敏感性去用来区分癌组织和非癌组织。我们的研究结果表明:作为IL-38的对照指标,曲线下面积为0.9584的IL-37是其中敏感性和特异性最强的生物标记物,并且也是最有潜力能够鉴别乳腺癌中癌组织与非癌组织的生物标记物;IL-38是其中敏感性特异性位居第二的生物标记物;IL-36α,IL-36β和IL-36γ作为鉴别乳腺癌癌组织和非癌组织的指标均不是最佳选择,但IL-36β仍是在IL-36细胞因子中表现最好的因子。

  3.4.2.4乳腺癌癌组织中IL-36、IL-37和IL-38的表达量与患者生存时间的生存曲线

  3.4.2.4.1乳腺癌癌组织中IL-37和IL-38的表达量与患者生存时间的生存曲线

  根据我们得出的结果可以总结出IL-37的低表达组患者的生存率要高于IL-37高表达组的生存率。根据研究显示,IL-37已经被证实是一种抗肿瘤的细胞因子在多个疾病中抑制肿瘤的转移和侵袭[73,74]。但我们惊奇的发现在一些研究中,IL-37不仅可以作为抑制肿瘤的细胞因子存在肿瘤中并且也具备一种促瘤因子呈现较差的生存率[84]。并且在近期的一项研究中显示,IL-37具有促进血管生成的作用[85]。而肿瘤的发展依赖于血管生成,IL-37促进肿瘤缺氧区新生血管形成的能力可能是IL-37促肿瘤发生的重要功能之一。然而相关报道显示,IL-37在有淋巴结转移的OSCC细胞中的表达低于无淋巴结转移的OSCC细胞,提示IL-37可能在细胞转化中起作用,但一旦细胞恶性化,IL-37就具有抑制肿瘤发生的作用[86]。这也就不难解释在我们实验中,IL-37在肿瘤中的低表达呈现了高生存率的现象。IL-37像是一把双刃剑,在特定的时段呈现着非常良好的抑制肿瘤的能力,而在一些阶段却表现着促瘤的能力。在未来的实验中我们非常急切的希望通过完整的数据进一步的探究IL-37在肿瘤中的表现。这一切的结果都最终证明着IL-37是一个具备着良好能力的指导治疗乳腺癌的新靶点。

  同样根据数据,我们可以得出IL-38的高表达组的生存情况要好于低表达组的生存情况,虽然都不具备统计学意义,这正是与IL-37所表达不同之处,IL-38作为癌症和炎症的抑制因子,癌组织中的高表达则理应对应高生存率的表现。尽管因为IL-38随访例数不足的原因导致不具备统计学意义,但我们仍然可以看到高表达组相对较好的生存率的这种趋势,根据所有趋势我们也可以看出IL-38在肿瘤微环境中呈现着抑制肿瘤发生发展的作用并且呈现着较好的生存率。而有相关报道可以证明IL-38和IL-37正相反,IL-38有着抑制血管生成的作用。Jing Zhang等人研究表明,IL-38可能作为IL-1家族拮抗剂发挥其功能,可能参与血管生成。根据实验发现体内施用IL-38可显着抑制视网膜血管生成。IL-38以剂量依赖性方式减弱内皮细胞的增殖,迁移和血管形成。通过添加抗IL-38抗体消除IL-38的抑制作用。这些结果表明IL-38是病理生理性血管生成的调节剂[87]。所以可以说明就目前而言IL-38不仅作为一种众所周知的抑炎因子在炎症性疾病中发挥着作用,并且也在各个肿瘤中发挥着不小的抗肿瘤能力,而且有能力作为一种优秀的生物标记物在乳腺癌的筛查和治疗中起到作用。我们希望在未来继续深入探究IL-38在乳腺癌中抑制肿瘤生发展的相关机制研究。

  还有一种有趣的观点,IL-38具有特征性的剂量反应曲线,使人联想到IL-37[30]。IL-37与IL-18R的结合募集了SIGIRR(Single Ig IL-1-related receptor),这是一种独特的现象,即低浓度的IL-37具有拮抗作用,同时增加浓度而浓度不会拮抗LPS诱导的TNF,IL-37甚至在较高浓度下也会增加TNF的产生[61]。有趣的是,低浓度的IL-38在阻断念珠菌诱导IL-17的反应方面更有效(在1-10 ng/mL范围内),而更高剂量不会阻断细胞因子的诱导;高浓度的IL-38会诱导更多IL-17的产生,这种模式非常类似于IL-37的生物活性极为相似[30]。所以说IL-37可以作为IL-38的对比指标来评估IL-38的在肿瘤中的作用。在本次研究中可发现,IL-37比IL-38在乳腺癌中不仅在癌组织与非癌组织中的表达,而且在与患者生存时间所对应的生存曲线中都呈现出比IL-38具备更好的预测肿瘤进展和患者术后生存时间的能力。

  3.4.2.4.2乳腺癌癌组织中IL-36的表达量与患者生存时间的生存曲线

  结果显示乳腺癌患者的癌组织中,IL-36α和IL-36β高表达组的患者生存率都要高于IL-36α和IL-36β和低表达组。根据生存曲线可知IL-36α、IL-36β所呈现出极高的统计学意义,因此推测IL-36α和IL-36β可能在乳腺癌的发展中表现为抗肿瘤的作用,其机制可能是通过激活适应性T细胞免疫应答,募集CD3+和CD8+的肿瘤浸润淋巴细胞,从而实现抗肿瘤的作用[82]。

  此外,癌组织中IL-36γ低表达的乳腺癌患者的术后生存率要高于IL-36γ高表达的患者。这正如我们之间得知IL-36γ独特的抑瘤机制。有研究显示,IL-36γ可以增强CD8+T细胞,NK细胞和γδT细胞的功能,将肿瘤微环境转变为一种有利于肿瘤破坏的细胞,并最终具有强大的抗肿瘤作用[26]。所以综上所述,我们猜测IL-36α和IL-36β对比IL-38在乳腺癌的发生发展中起到了更关键的作用,并对未来临床治疗乳腺癌提供了一个可能的靶点。虽然IL-36γ表达量与患者生存时间的生存曲线并不存在统计学意义,但由于它独特的抑制肿瘤的机制和相对成熟的研究,我希望在未来会更加系统的去探究IL-36γ在不同种肿瘤的抑制途径和蛋白表达水平。

  3.4.2.5乳腺癌癌组织中IL-36、IL-37和IL-38的表达量在患者绝经期前后中的差异

  根据数据我们发现,IL-36、IL-37和IL-38在绝经期前后患者中表达的柱状图中均没有统计学意义,原因可能因为此次实验的患者大多数都集中在绝经期后,而绝经前患者的数量不足绝经后患者数量一半,所以导致其结果。或者IL-36、IL-37和IL-38在乳腺癌中的表达与患者绝经前后并不存在意义。为了克服此问题,我们会在将来收集更多的绝经期前的患者样本以便于研究。